对虾细胞的分子重编程与永生性转化研究

为解决体外培养对虾细胞难以脱分化和有丝分裂寿命短这样两个制约对虾细胞建系的棘手问题,本研究拟分别克隆对虾重编程因子基因：c-Myc、Oct3/4、Sox2和Klf4，并构建相应的泛嗜性反转录病毒重组载体(pMCs-Puro)，通过包装细胞（Platinum-GP）包装成病毒后，再分别以单因子和多因子组合形式感染体外培养对虾细胞，过表达，并观察感染后对虾细胞的生长特性,以确定以上转录因子单个或多个因子组合诱导对虾细胞发生重编程(即脱分化)与永生性转化的能力和效果,为最终实现体外培养对虾细胞的永生性转化奠定基础。争取建立对虾永生性细胞系,从而在水生无脊椎动物永生性细胞系的建系方面实现零的突破。

为实现对虾细胞的永生性转化，本项目首先改进并建立了成熟有效的对虾Oka器官原代和传代细胞培养技术，原代和传代培养效果达到国际先进水平，为顺利开展对虾细胞的基因转染工作奠定了基础。其次，克隆得到含有完整ORF的对虾重编程和永生性转化相关基因7个，包括对虾翻译控制肿瘤蛋白（TCTP)、POU3、端粒酶逆转录酶（TERT）、Lin28、DAD1、Survivin和Cyclin E基因，分别构建了报告基因表达载体，并已在哺乳动物和鱼类细胞中成功表达，观察到强荧光信号。其中TCTP基因已成功在对虾细胞中过表达，并观察到初步的促生长效果。但是，对虾重编程4因子的基因克隆未获成功，其中klf4已获得全长，但其ORF的扩增因其高GC含量而未获成功，Oct4、Sox2和c-Myc只得到1-2个保守片段。. 我们在对虾细胞的脂质体转染中发现，脂质体法可以把外源质粒DNA导入对虾细胞内，但哺乳动物病毒来源的强启动子CMV和长末端重复序列（LTR）不能有效驱动外源基因在对虾细胞中的有效转录，因而观察不到荧光。为此，我们克隆了对虾来源TCTP基因启动子Ptctp和对虾WSSV病毒来源启动子Pie1，分析了其在哺乳动物、鱼类和对虾细胞中的启动活性。发现虾源启动子Ptctp和Pie1-504优于Pcmv和 PLTR，可有效驱动报告基因在对虾细胞中的表达，可观察到荧光，但其效率仍远低于哺乳动物细胞。. 我们还发现商品化的泛嗜性逆转录病毒基因转移系统难以侵染对虾细胞，故对现有系统进行了改造，一方面采用了虾源启动子Ptctp，以提高病毒载体在对虾细胞中的表达效率；另一方面通过共表达，将对虾WSSV囊膜蛋白VP19和VP28引入包装病毒囊膜，以提高所包装病毒对对虾细胞的亲嗜性，从而建立了嗜对虾细胞的逆转录病毒报告基因转移系统。. 为获得活跃分裂的对虾原代细胞培养物，本项目又启动了对虾胚胎细胞培养，成功得到原代培养胚胎细胞单层和传代细胞，初步建立了对虾胚胎细胞原代和传代培养方法。 . 为了解决对虾细胞难转染问题，本项目还克隆了72 bp SV40增强子序列以及对虾WSSV病毒来源的具有核靶向序列DTS潜能的5个片段，分析了其在对虾细胞中的活性。同时，还对贴壁生长细胞的电穿孔转染条件进行了条件摸索。