苜蓿秋眠性调控基因的筛选及功能鉴定

苜蓿的秋眠性是指苜蓿在夏末和秋季所表现出来的植株生长速率下降、茎枝匍匐生长的一种特性。过去近百年来从秋冬季节不同秋眠型苜蓿可溶性糖的含量多寡来研究苜蓿的秋眠性显然走入了误区，苜蓿秋眠性的调控基因及其作用机理都不清楚。本项目首先采用mRNA表达高通量分析方法筛选出调控苜蓿秋眠的基因，再用生物信息学分析差异基因中哪些基因可能是调控苜蓿秋眠的主要基因，然后利用基因克隆、基因沉默、转基因技术来研究这些基因的功能以此来确定苜蓿秋眠的调控基因，最后采用实时荧光定量PCR研究各调控基因之间的相互作用。此课题的实施和完成能筛选鉴定出调控苜蓿秋眠的主要基因以及推测出其内在的联系，为苜蓿秋眠性分子机理的阐明奠定基础，同时也为培育优良的苜蓿品种提供依据。

苜蓿( Medicago sativa L. )的秋眠性是指苜蓿在夏末和秋季所表现出来的植株生长速率下降、茎枝匍匐生长的一种特性，这种生长的适应性与其抗寒性和生产性能密切相关。紫花苜蓿是长日照植物，长日照有利于其生长，秋季、冬季光照时间变短，温度下降的时候发生休眠。但是目前苜蓿秋眠性的调控基因及其作用机理不清楚。本项目拟采用RNA-seq、iTRAQ 高通量分析方法对国际上秋眠型和非秋眠型苜蓿标准对照品种筛选出在秋季二者差异的基因和蛋白，利用生物信息学分析筛选出调控苜蓿秋眠的主要基因，利用基因克隆、基因沉默、转基因技术验证这些基因的功能，并采用实时荧光定量PCR研究重要基因的表达趋势和差异以及基因间的关系。. RNA-seq分析共得到秋眠型苜蓿5月份和9月份样品间差异倍数大于2、误差小于0.05的410个差异基因，在9月份秋眠型和非秋眠型苜蓿的差异基因为380个。从中选出重要的差异基因42个，对其进行荧光定量，其中19个表达具有规律性。发现了28个关键的调控休眠microRNA，包括20个已知的microRNA和8 个novel microRNA。. iTRAQ定量分析共得到差异倍数大于1.2、误差小于0.05的90个差异蛋白，差异倍数大于1.5、误差小于0.05的26个差异蛋白，秋眠型苜蓿相对于非秋眠型苜蓿，56差异蛋白上调，34个下调；对90个差异蛋白中的酶进行了荧光定量，其中80%的酶的表达具规律性，并且秋眠型和非秋眠型苜蓿间有的表达趋势相反，有的表达趋势相同但表达量有较大差异。. 成功克隆了8条差异倍数大的未知基因或蛋白的核酸序列，原核表达了两个蛋白，确定了两个新蛋白的存在。转基因结果表明，光敏色素、激素等在调控秋眠中起重要作用。. 本项目的大部分结果在国内外秋眠研究中为首次提出，是紫花苜蓿秋眠性的最新研究进展，为深入全面阐明苜蓿秋眠的机理提供了坚实的科学基础和明确的研究方向，同时为培育优良的苜蓿品种提供基础和依据。