化瘀软坚解毒法通过miR-21/mTOR信号通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的作用及机制

Based on clinical experience of Huayu Ruanjian detoxification method treating keloid, further studies have shown that Huayu Ruanjian detoxification method can suppress the abnormal proliferation of keloid fibroblasts, but the exact mechanism is unclear. Recent studies have found that miR-21 and mTOR signaling pathway plays an important role in the process of keloid formation, and the miR-21 target gene PTEN is negative feedback regulator of mTOR signaling pathway. Accordingly, by investigate miR-21 regulating mTOR signal pathway,this project research the cell biological mechanisms of Ruanjian detoxification method to inhibit the proliferation of keloid. The project, using human keloid and normal skin tissue, keloid nude model, human keloid fibroblasts as for research subjects, and Huayu Ruanjian detoxification method to intervene, from the tissue-model-cell three levels to study mTOR signaling pathway molecules expression in keloid tissue and fibroblasts, and the regulation of miR-21 and its mechanism, as well as explore the intervention and targets of Huayu Ruanjian detoxification method. The study is expected to further reveal the molecular mechanism of keloid fibroblasts abnormal proliferation, and determine the specific mechanism of Huayu Ruanjian detoxification method inhibiting keloid proliferation.

基于“化瘀软坚解毒法”治疗瘢痕疙瘩的临床经验，课题组进一步研究证明化瘀软坚解毒法能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖，但其具体机制尚不清楚。近期研究发现miR-21及mTOR信号通路在瘢痕疙瘩形成过程中具有重要作用，而且miR-21的靶基因PTEN是mTOR信号通路负反馈调节因子。据此，本项目从探讨miR-21对mTOR信号通路的调控角度来研究化瘀软坚解毒法抑制瘢痕疙瘩增生的细胞生物学机制。项目以人瘢痕疙瘩和正常皮肤组织、瘢痕疙瘩裸鼠模型、人瘢痕疙瘩成纤维细胞为研究对象，化瘀软坚解毒法为干预手段，从组织-模型-细胞三个层次来研究mTOR信号通路关键分子在瘢痕疙瘩组织及其成纤维细胞中的表达情况及miR-21的调控作用和机制，同时探讨化瘀软坚解毒法的干预作用和靶点。预期本项目的研究，将会进一步揭示瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖的分子机制，明确化瘀软坚解毒法抑制瘢痕疙瘩增生的相关机理。

瘢痕疙瘩不仅影响美观，还可因瘢痕挛缩而造成严重的功能障碍，给患者身心健康带来严重危害。本课题组在“湿毒搏结，气血瘀滞”病机理论指导下，以化瘀软坚解毒法为组方原则创制的五倍子瘢痕膏治疗瘢痕疙瘩临床疗效确切，且前期研究发现其能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，但具体作用机理尚不清楚。本项目旨在前期研究基础上进一步深入研究化瘀软坚解毒法抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的分子机制。有研究显示miR-21及mTOR 信号通路在瘢痕疙瘩形成过程中具有重要作用，而且miR-21的靶基因PTEN是mTOR信号通路负反馈调节因子。本项目通过应用RT-PCR、免疫组化、细胞转染、双荧光素酶报告基因实验、Western Blot、CCK8细胞增殖检测、流式细胞术等多种分子生物学技术探讨了miR-21及mTOR信号通路关键分子在瘢痕疙瘩中的表达情况及五倍子瘢痕膏对其的调控作用。研究结果显示，miR-21、PI3K、Akt、mTOR在正常皮肤组织中低表达，而在瘢痕疙瘩组织中高表达，经五倍子瘢痕膏干预后其表达量明显降低；PTEN在正常皮肤组织中高表达，而瘢痕疙瘩组织中低表达，经五倍子瘢痕膏干预后其表达量明显升高。miR-21与PTEN之间存在靶向调控关系。转染miR-21 mimic后瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-21表达增加，PTEN表达降低而P-Akt、P-mTOR表达增加，且能明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并抑制其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能减弱这一作用且呈浓度依赖性。转染miR-21 inhibitor后瘢痕疙瘩成纤维细胞miR-21表达降低、PTEN表达增加及p-Akt、p-mTOR表达降低，且能明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并促进其凋亡，而五倍子瘢痕膏提取液能增强这一作用且呈浓度依赖性。以上研究结果表明，五倍子瘢痕膏抑制瘢痕疙瘩增生的机制可能与其通过抑制miR-21表达而上调PTEN表达，进而下调mTOR信号通路中PI3K、Akt、mTOR表达有关。本项目研究揭示瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖的部分分子机制，明确了化瘀软坚解毒法抑制瘢痕疙瘩增生的相关机理，为其临床推广应用提供了理论依据，也为中医药理论指导下的瘢痕疙瘩研究提供了新的思路，因而具有重要的科学意义。