转录因子NKX2.5及SRF对TBX1的转录调控

TBX1, which regulates the cell proliferation in the second heart field and the formation of aortopulmonary septation,plays a critical role in the development of cardiac outflow tract. The abnormal expression of TBX1 is invovled in the pathogenesis of congenital heart defects, yet the regulation of TBX1 expression is still unclear. Sequence analysis showed that there were potential SRF- and NKX2.5-binding sites in the TBX1 gene promoter, we predict that SRF and NKX2.5 may play an role in regulating TBX1 expression. We will identify the interaction among them in EMSA, ChIP, gene transfer, RNA interference and reporter gene assays. Furthermore, clarify the relationships between the SNPs in TBX1 promoter and the pathogenesis of CTDs by sequencing the promoter region of TBX1 gene in patients with conotruncal heart difects(CTDs). This study will help us to further understand the signal pathway of TBX1 in the development of cardiac outflow tract, the underlying molecular mechanisms of CTDs, and may provide some clues in the molecular markers for early diagnosis of congenital heart defects.

TBX1基因在心脏流出道发育过程中发挥重要作用，参与调控第二生心区细胞增殖及主肺动脉隔形成。TBX1表达调控异常可引起心脏畸形，但其表达调控机制尚不清楚。序列分析发现TBX1基因启动子区存在潜在SRF-及NKX2.5-结合位点，推测NKX2.5、SRF参与TBX1转录调控，且二者存在相互作用。我们将用凝胶阻滞分析、染色质免疫共沉淀、基因转移、RNA干扰和报告基因等方法探讨其相互作用，并在人群验证TBX1基因启动子区核苷酸变异与心脏圆锥动脉干畸形相关性，探索胚胎心脏圆锥动脉干发育中TBX1基因作用通路，为进一步理解心脏圆锥动脉干畸形发病机制，研发用于先天性心脏病早期诊断的分子标志提供基础。

TBX1基因在心脏流出道发育过程中发挥重要作用，参与调控第二生心区细胞增资及主肺动脉隔形成。TBX1表达调控异常可引起心脏畸形，但其表达调控机制尚不清楚。本研究通过，1、构建不同长度TBX1基因启动子驱动的荧光素酶报告基因载体，验证不同长度启动子活性，发现转录其实位点上游1.2kb区域是TBX1基因启动子关键区域，与文献报道一致。2、荧光素酶报告基因检测显示，带有TBX1基因第一内含子区的TBX1-TP5（-138/+514）报告基因载体活性最强，推测该区段含有调控TBX1转录的增强子。3、细胞转染、荧光素酶报告基因实验显示，转录因子NKX2.5、SRF、GATA6对TBX1-TP5均具有调控作用，其中GATA6显著增强其转录激活能力。免疫组化实验显示，GATA6及TBX1在小鼠E13.5及人类S13阶段胚胎腮弓共表达，提示二者存在相互作用。体外实验显示，增加GATA6蛋白表达，可显著上调C2C12细胞TBX1表达水平。EMSA实验结果显示，GATA6可以直接结合该区段（-138/+514）内的GATA结合位点。4、对238例先天性心脏病患儿进行TBX1基因测序分析，发现TBX1基因第一内含子区（-138/+514）存在5例罕见变异位点，其中4例罕见位点变异位于GATA结合位点。荧光素酶报告基因实验结果显示，这些变异位点影响GATA6对TBX1的转录调控，从而参与心脏畸形的发生。5、课题组选取605例心脏圆锥动脉干畸形患儿，提取外周血DNA，进行TBX1基因启动子区测序分析及生物信息学软件预测，发现TBX1启动子区罕见位点变异可能与人类心脏圆锥动脉干畸形发生相关。本课题首次提出GATA6可与TBX1基因第一内含子区增强子直接结合，在胚胎发育中正向调控TBX1的转录调控，为进一步理解先天性心脏病发病机制，研发用于疾病早期诊断的分子标志提供基础。