酿酒酵母亚细胞区室合成白藜芦醇的系统代谢工程研究

Resveratrol is a kind of high-value added natural polyphenols, which has important physiological functions, such as anticancer and anti-inflammatory, and is widely used in medicine, food and other fields. At present, resveratrol is produced by directly extracting from plants. However, the production cost of resveratrol from plants is high due to the low contents of resveratrol in plants and the long growth cycles of plants. Therefore, it is of great significance to develop microbial fermentation for resveratrol production. Saccharomyces cerevisiae is the main strain for the study of the biosynthesis of resveratrol. However, the synthesis of resveratrol in S. cerevisiae has been limited in the cytoplasm, and the insufficient supply of acetyl coenzyme A in the cytoplasm limited the resveratrol production. This project will use S. cerevisiae for the biosynthesis of resveratrol. Firstly，the biosynthesis pathway of resveratrol will be reconstructed in the peroxisome to utilize acetyl coenzyme A generated by beta oxidation to synthetize resveratrol. Secondly, the aldehyde dehydrogenase from Escherichia coli will be over-expressed in the cytoplasm to increase the supply of acetyl coenzyme A, and the biosynthesis pathway of resveratrol will also be constructed in the cytoplasm.Finally, transporters for resveratrol efflux will be screened and is used to establish efflux module of resveratrol for reducing the cytotoxicity of resveratrol. This project will offer a new idea for the biosynthesis of resveratrol and provide new strategies and practical experiences for the production of natural products using subcellular structures of eukaryotes.

白藜芦醇是一种天然多酚类物质，具有抗癌和抗炎症等重要生理功能，广泛应用于医药及食品等领域。目前白藜芦醇的生产方法为植物提取，但植物生长周期长及白藜芦醇含量低等原因导致生产成本过高。因此研究低成本微生物发酵法合成白藜芦醇具有重要意义。酿酒酵母是研究微生物发酵法合成白藜芦醇的主要出发菌株，但目前白藜芦醇合成的研究还仅局限于细胞质中，合成前体乙酰辅酶A的供给不足严重限制了白藜芦醇产量的提高。本项目拟以酿酒酵母为研究对象，在其过氧化物酶体内重构白藜芦醇合成途径，利用β-氧化生成的乙酰辅酶A经丙二酰辅酶A合成白藜芦醇；同时在其细胞质中引入大肠杆菌乙醛脱氢酶，增加胞质内乙酰辅酶A的供给，在胞质内建立白藜芦醇合成途径。筛选和鉴定白藜芦醇外排转运蛋白，并在细胞膜上建立白藜芦醇外排转运系统以减少其细胞毒作用，实现白藜芦醇的高效合成。本项目的完成将为应用真核生物亚细胞结构合成白藜芦醇等天然产物提供实践经验。

酵母是微生物发酵法合成白藜芦醇的主要出发菌株，但目前白藜芦醇合成还仅局限于细胞质中，合成前体的供给不足限制了产量的提高，导致发酵产量较低难以满足产业化需求。因此，充分利用过氧化物酶体中的乙酰辅酶A生成前体丙二酰辅酶A为合成白藜芦醇提供了一个新的途径。本项目以酿酒酵母为研究对象，首先在酵母中建立了CRISPR-Cas9介导的多拷贝整合技术，实现了酵母多基因、多拷贝整合。进一步合成了植物来源的酪氨酸氨解酶 TAL、4-香豆酸辅酶A 连接酶 4CL 和芪合酶 STS的表达基因，利用所建立的技术分别将这三个基因及信号肽SKL整合到酿酒酵母基因组中，首次在酿酒酵母过氧化物酶体内构建了白藜芦醇合成途径，白藜芦醇的积累量从0增加到32.81±0.21mg/L。对合成基因拷贝数比例的进行匹配，调优化合成模块组分提高白藜芦醇产量，发酵罐发酵检测白藜芦醇的产量达到123.85mg/L。以丙二酰辅酶 A 和酪氨酸作为前体经白藜芦醇合成模块生成白藜芦醇，丙二酰辅酶 A由乙酰辅酶 A 可以经乙酰辅酶A 羧化酶 Acc1p 生成。为了增强前体物供应，过表达ACC1-SKL的菌株以增强丙二酰辅酶A供给；构建过表达了aldA基因以增强乙酰辅酶A供给，脂肪酸进入过氧化物酶体后经过β -氧化生成乙酰辅酶 A，通过强化β-氧化途径酶（ POX1、FOX2、POT1等）表达以促进脂肪酸氧化增加乙酰辅酶A供给。同时在细胞质内建立了白藜芦醇合成途径；接下来整合了过氧化物酶体和细胞质内合成模块，筛选鉴定转运蛋白以增强白藜芦醇向外转运，通过系统优化后获得白藜芦醇高产菌株，产量达到179.87mg/L。为进一步提高工程菌发酵性能和白藜芦醇产量，本项目在临近空间极端环境开展酵母工程菌适应性进化，以期优化发酵培养基和发酵条件，提高白藜芦醇放大发酵的生产能力与产量。本项目的完成将为白藜芦醇生产菌培育与产业化提供新技术，为真核生物亚细胞区室合成白藜芦醇等天然产物提供实践经验。