酿酒酵母终止子元件的设计及途径工程应用

Because of its high robust and safety, Saccharomyces cerevisiae has become an important platform for production of biofuel, natural products and novel biomaterials. However, the complex nature of biological systems and the limited fine regulation strategy for pathway have limited the biosynthesis efficiency of pathway in Saccharomyces cerevisiae. In view of the regulation mechanism of eukaryotic gene expression and the important status of terminator in gene expression of yeast, in the project the terminator technology will be applied to the fine regulation of yeast pathway engineering. To do this, the terminator parts will be firstly mined from the genomes of Saccharomyces cerevisiae and their activities will be then evaluated. The key core area affecting the terminator activity will be researched, and the regulation mechanism of terminator will be established. Based on the in-depth study of the effect of subtle sequence and structure features of key core area on terminator activity, the design principle and method for artificial controllable terminator will be established. The terminator library which has more advantages than natural terminator will then be constructed. In order to improve the efficiency of yeast these artificial terminators will eventually be applied to the fine regulation of glycyrrhetinic acid and carotenoid biosynthetic pathway. Through this project, we hope to develop a method based on the terminator regulation principle for yeast pathway optimization, and can provide a new idea and way for regulation of yeast pathway engineering.

酿酒酵母具有的高鲁棒性和安全性使其发展成为生物燃料、高值天然产物和生物材料的一种重要生产平台，但由于生物系统自身的复杂属性和当前途径精细调控策略的局限，限制了途径合成效率。鉴于真核生物基因表达调控机制和终止子在酵母表达调控中的重要地位，项目拟将终止子技术应用于酵母途径的精细调控中，开展酿酒酵母终止子元件的挖掘和活性评估，研究影响终止子活性的关键核心区与调控表达的规律，深入解析关键核心区中细微序列、结构特征对终止子活性的调节作用，进而建立人工可控终止子的设计原理和技术方法，构建较天然终止子具有更多优势的终止子库，最终将其应用于甘草次酸和类胡萝卜素两个生物合成途径的精细调控中，以提高酵母途径效率。通过研究，期望能够开发出一种源于终止子调控原理的酵母途径优化方法，为酵母途径工程的精细调控提供新思路和新方法。

真核生物复杂的遗传特性造成其中开发出的控制元件相对单一，限制了合成线路的构建和应用。项目基于真核生物基因表达调控机制和终止子在酵母表达调控中的重要地位，开展了酿酒酵母终止子元件的挖掘和活性评估，解析了终止子结构特征对其活性的调节作用，研究了人工可控终止子的设计方法，并将其应用于番茄红素生物合成途径的精细调控中，取得了以下主要研究结果。.（1）构建了含有 100 个天然终止子的文库，建立了终止子活性划分标准，将其划分为强终止子、中强度终止子和弱终止子。.（2）证明蛋白质表达与终止子活性有关，发现强终止子的使用能有效提高 mRNA 和蛋白表达，且效率元件是控制终止子活性的主要元件。弱启动子结合强终止子的使用能达到和强启动子基因表达相同的效果，但终止子作为基因元件独立于编码区序列行使转录终止功能。.（3）建立了利用linker序列调节人工终止子活性的方法，形成了含有266个人工终止子的文库，其强度范围为 2.3648~3.5270，平均荧光强度值为3.0719。人工终止子的活性随着终止子linker 1序列 GC含量的升高而降低，随着 linker 1序列中T的增加而增加。但茎长 （由 linker 2序列构成）的改变对不同强度人工终止子产生不同程度的影响：弱终止子和中强终止子茎长的改变导致mRNA和蛋白质产量升高。.（4）发明了一种具有启动、终止双功能调控元件的构建方法。通过优选启动和终止序列，确定了按照先终止后启动的原则组装启动与终止序列，理性构建形成启动终止双功能调控元件，达到互不干扰的启动终止功能。.（5）以番茄红素生物合成途径为验证对象，采用不同强度人工终止子构建基因表达模块和途径，发现使用中等强度终止子的菌株控制番茄红素合成途径表达时，番茄红素产量达到最高，提高60%。.研究表明，人工终止子大幅度缩短了酵母天然终止子的长度，有利于简化途径构建过程，在在基因表达和代谢途径精细控中具有较大的应用潜力，且为开发合成生物学元件和异源合成途径优化提供了科学的理论参考。