家蚕BmMLs和BmToll9响应LPS引发免疫和自噬的研究

脂多糖（LPS）可以通过TOLL途径诱发哺乳动物的免疫反应和细胞自噬，但不能诱导双翅目昆虫果蝇抗菌肽的表达。最近研究发现LPS可以诱导鳞翅目昆虫家蚕抗菌肽的表达，说明家蚕对LPS的免疫反应通路与果蝇的TOLL和IMD信号通路不同。我们前期研究发现，LPS可以诱导家蚕受体蛋白BmMLs和抗菌肽Glov1高表达，结构功能分析也提示BmToll9可能参与了LPS的识别。因此我们推测：家蚕的TOLL途径存在着一个旁路分支，LPS能够不依赖于细胞介素Sp?etzle，直接与BmMLs结合后被BmToll9识别，从而启动TOLL信号途径诱导抗菌肽的表达和细胞自噬。本项目拟通过LPS诱导家蚕后细胞自噬的检测、BmMLs和BmToll9对LPS的结合试验及BmToll9的RNAi等方法，研究BmMLs和BmToll9在LPS诱导家蚕免疫反应通路中的作用，为阐明鳞翅目昆虫先天免疫信号通路提供科学依据。

昆虫对病原物的防御方式为先天免疫(innate immune)，果蝇（Drosophila）中，PGRP-SA/SD识别Lys-PGN后活化Späetzle，进而与Toll受体结合，启动Toll信号途径。脊椎动物也通过TLR（Toll-like receptor）识别病原物，但其可以直接识别不同的PAMPs。研究表明脂多糖（LPS）通过TLR4引起哺乳动物强烈的免疫反应和自噬，我们在家蚕（Bombyx mori）的研究中发现LPS能引起家蚕抗菌肽的表达，预示着家蚕中有受体可以识别LPS并诱发先天免疫，为了研究鳞翅目昆虫经LPS诱导后其先天免疫情况，及跨膜受体Toll在进化上的功能，我们以家蚕为模式生物，进行了以下内容的研究：（1）通过抑菌实验检测LPS引发活体家蚕的免疫反应的情况。（2）原核表达家蚕ML蛋白BmEsr16、BmML-1，Elisa检测其是否能和LPS体外结合。（3）克隆BmToll9至PIEX-4-GFP载体，转染家蚕细胞，研究BmToll9是否对LPS有响应。（4）构建基因表达谱数据库，筛查响应LPS诱导的下游免疫相关基因。.本研究获得了以下结果：.1. LPS等诱导家蚕6-18h后，提取家蚕血淋巴，检测其抑菌活性，结果显示LPS可以诱导家蚕抗菌肽的表达。.2.以哺乳动物中响应LPS的蛋白质为模板，对家蚕基因组数据库进行BLAST搜索，寻找到了三条ML蛋白质序列及BmToll9，结构域的分析,发现BmToll9与TLR4在结构及进化上是最接近的。.3. RT-PCR获得BmEsr16、BmML-1基因，克隆表达获得纯化的BmEsr16和BmML-1重组蛋白，Elisa检测发现BmEsr16和LPS可在体外直接结合。.4. 克隆BmToll9基因至PIEX-4-GFP载体上，转化家蚕Bm12细胞，共聚焦显微镜观察到BmToll9基因成功表达并跨膜。用LPS诱导转染成功的细胞，qRT-PCR发现抗菌肽Moricin、Attacin1基因的转录表达活性上调，但是cecropinB6基因的转录活性没有显著变化，推测这两类抗菌肽可能通过不同的免疫途经进行调控。.5. 为了进一步筛查寻找可能的通路基因，我们构建了差异基因表达谱数据库，通过生物信息学分析找到了大量响应LPS的免疫相关因子，为进一步筛查LPS诱导的昆虫免疫反应做数据储备。