多肽芯片应用于高通量研究溴结构域和去乙酰化酶

Histone post translational modifications (PTMs) play critical roles in regulating gene transcription and expression. Recent advancement of mass spectrometry technology has led to the discovery of a series of novel PTMs on lysine residues of histone, such as succinylation and crontonylation. Despite the breakthroughs, the biological roles of most of these new PTMs still remain unknown. By identifying the proteins or enzymes that interact with these peptides which carry new acyl groups, we can further elucidate the biological roles and functions of these PTMs. In this proposal, we seek to develop a novel peptide array to systematically investigate the interactions between bromodomains (BRDs)/histone deacetylases (HDACs) and the peptides with new acyl groups. In addition, BRDs and HDACs both play crucial roles in epigenetic regulation. Through the proposed research, we hope to discover new peptide ligands that interact with BRDs/HDACs. The results obtained will allow further functional annotation of BRDs/HDACs and provide insight into novel biological mechanisms of transcription control. Moreover, we will employ peptide-small molecule hybrid array to develop potent and selective inhibitors for BRDs. The hits identified from the microarray experiments will be subjected to anti-proliferation assays with various cancer cell lines such as A549 cells and Hela cells. Through the proposed research, we envisage that new chemical tools will be developed for further advancements of epigenetics.

组蛋白的后修饰在基因表达调控过程中起着至关重要的作用。近年来，随着质谱分析技术的发展，组蛋白中赖氨酸的新型酰化方式相继被发现，如琥珀酰化、巴豆酰化等。绝大部分新型酰化方式的具体生物学功能尚未知，鉴定与其相互作用的蛋白或酶将帮助阐述这些新型修饰的生物学功能，促进表观遗传学的发展。在本项目中，我们致力于创建新型酰化多肽芯片，用以高通量研究溴结构域/去乙酰化酶和新型酰化多肽的相互作用。溴结构域和去乙酰化酶均为表观遗传学的重要功能蛋白，通过这项研究，我们将揭示溴结构域和去乙酰化酶底物选择性的规律，并引导发现溴结构域和去乙酰化酶新的生物功能和调控机制。另一方面，我们也将利用多肽-小分子杂合芯片技术来发展新的溴结构域小分子抑制剂，文献表明，溴结构域小分子抑制剂很有可能成为新型抗癌药物。筛选出有效抑制剂后，我们还将开展细胞实验以检测其抗癌活性。通过这项研究我们期望为表观遗传学提供全新和高效的化学工具。

本课题按原计划进行，完成情况良好，我们首先合成了含不同酰化多肽的芯片，探索了这些多肽与不同溴结构域的相互作用规律。实验表明，相较于乙酰化多肽，溴结构域对丙酰化或丁酰化多肽底物的识别能力较弱。一些巴豆酰化的多肽亦可被溴结构域识别，我们也用ITC或SPR实验佐证了芯片实验结果。大部分溴结构域对琥珀酰化多肽几乎不识别， 与香港大学的郝权老师课题组合作，赖氨酸琥珀酰化的读者蛋白首次被鉴定。我们亦鉴定出一些多肽对溴结构域或者Sirtuin有较强的亲和力，这将为设计溴结构域或Sirtuin的抑制剂提供关键信息。在实验进行过程中，我们亦设计了可以特异识别BRD4(1)的点亮型荧光探针，该探针对BRD4(1)有较好的响应能力和选择性。我们预期这个探针具有潜力应用到活细胞检测BRD4(1)实验中。此外，我们也开发了荧光探针可用于检测HDAC的催化活性。该探针对Sirt1/Sirt2显示了较好的响应能力，并且为抑制剂的筛选提供了有力的平台。在此基础上，我们设计了双功能探针可用于检测酶的催化活性和蛋白组学研究。实验结果表明，该探针可用于区别赖氨酸乙酰化的读者和橡皮擦。我们期待以上科研成果为表观遗传学的发展提供有力的化学工具。