连翘中具有神经保护作用先导物的发现

Based on the neuroprotection activity of the active fraction and novel chemicalconstituents from Forsythia suspensa in vivo and in vitro, this project plans to systematically study its active constituents by using target tracing isolation combining with pharmacological results and the fast, microamount, online isolation and analysis methods. At the same time, the project will investigate the neuroprotection activity of these compounds against rotenone, lipopolysaccharide, or β-amyloid induced toxicity in PC12, and the influence on 1) oxidative stress, 2) neuro-inflammatory, and 3) mitochondrial damage. On the basis of these findings, their structure-activities relationship will be summarized. With the evaluation of animal models assay in vivo, the bioactive substances with neuroprotective from Forsythia suspensa would be clarified and the basic chemical structure features of compounds might be obtained. Eventually, the bioactive compound would be a lead in drug discovery and a base of a new drug with independent intellectual property.

基于连翘有效部位及其结构新颖单体化合物在神经保护方面体现出的优良活性，本项目拟采用不同的特异性药物靶标跟踪筛选并结合现代微量、快速、在线等集成的分离分析方法，构建以活性结果和紫外光谱特征为指导的靶向分离策略，对常用中药连翘活性分子群进行系统研究，在此基础上，利用已建立的体内外活性筛选平台，重点考察这些化合物对鱼藤酮、脂多糖、β淀粉样肽损伤PC12细胞的保护作用，并探讨其对1）氧化应激、2）神经炎症、3）由于氧化应激及神经炎症所导致的线粒体功能损伤的影响，进行构效关系研究。结合体内活性评价，诠释连翘在神经保护方面的药效物质基础，同时获得具有神经保护活性作用的活性物质基本结构特征，结合构效关系研究优选出同时具有新颖结构和高活性的先导化合物，为创新药物研究提供先导结构，为进一步开发具有自主知识产权的新型药物奠定基础。

本课题主要对连翘中的化学成分及药理活性进行了系统研究。采用多种柱色谱技术联用从正丁醇部位30% 和50%亚部位得到了133个化合物。包括新化合物40个，已知化合物93个。此外，首次从连翘中分离得到了4个结构骨架新颖的15元大环苯乙醇苷以及黄酮苷与苯乙醇苷的加合物。药理活性研究发现连翘活性部位具有良好的抗帕金森症活性, 体内实验结果表明，通过对大鼠单侧脑黑质部位注射鱼藤酮可导致大鼠脑黑质部位的多巴胺能神经元丢失, 而活性部位在给药浓度为 (250 mg/kg) 时,可以显著提高多巴胺能神经元的表达和数目、降低a-synuclein的表达, 改善大鼠PD样运动障碍。此外，单体化合物药理活性筛选结果显示，化合物forsythoneoside A-D在体外能够有效抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤, 给药浓度达0.1 μM时, 化合物forsythoneoside B和forsythoneoside D可将细胞存活率由53.9%分别提高到70.1%和67.9%; 对化合物forsythoneoside B的神经保护作用机制进行初步研究发现, 该加合物能有效改善脂多糖 (LPS) 诱导的小胶质细胞神经炎症反应, 并可抑制NF-κB通路的激活, 从而降低炎症因子的释放, 因此具有良好的抗帕金森病作用。化合物1, 2, 3, 5, 6, 8, 11, 12, 19, 26, 46, 53, 54, 55, 56, 57和 97在浓度为10 μM时对鱼藤酮和去血清导致的PC12细胞损伤具有良好的保护作用，甚至当浓度降低为1 μM时，化合物8和56仍然显示了较好的保护作用，其结果与模型组对比具有统计学差异。化合物3和32对小鼠巨噬细胞释放TNF-α具有明显抑制作用，其IC50值分别为1.296 μM 和1.053 μM。.本课题在确定化合物立体结构时，建立了一种基于H2-1化学位移差值快速简便确定2-O-取代苯乙醇苷2位绝对构型的氢谱方法。此外，还建立了一种基于H2-9′和H2-9′化学位移差值确定双四氢呋喃木脂素相对构型的方法。同时，针对8-O-4’型木脂素苷类化合物绝对构型判断方面的问题，本课题组通过总结归纳8-O-4’型木脂素苷类化合物H-9位的化学位移，从而不需对化合物进行水解，就可以准确的判断8-O-4’型木脂素苷类化合物C-7和C-8位的相对构型。