捻转血矛线虫Hc-daf-22参与线虫滞育的分子机制研究

进入滞育阶段是反刍动物主要胃肠道寄生虫捻转血矛线虫越冬的主要方式。课题组发现一个在滞育阶段高丰度表达的EST序列与秀丽隐杆线虫Ce-daf-22高度同源，定名Hc-daf-22。扩增全长cDNA，发现Hc-daf-22与Ce-daf-22氨基酸同源性达80%以上，决定Ce-DAF-22硫解酶活性的功能域高度保守；加之基因在进入滞育前的ExL3及L4期也较高丰度表达，申请者推测其参与了滞育形成，且功能与Ce-DAF-22相似。本项目拟首先弄清与Hc-daf-22功能相关的基因结构特征；通过基因表达的组织特异性与超微结构分析，伴随期表达特异性检测，阐明Hc-daf-22基因表达的时空分布，推测行使功能的主要方式；然后运用RNAi技术，结合秀丽隐杆线虫突变体拯救，分析基因的可能功能，阐明Hc-daf-22在捻转血矛线虫滞育形成中的作用机制，为进一步解释寄生性线虫滞育的信号通路和分子机制奠定基础。

本研究在通过mRNA差异显示技术获得的Hc-daf-22基因EST序列基础上利用RACE技术获得了基因的完整cDNA序列，全长共1602bp，共编码533个氨基酸；通过基因步移技术获得了基因组DNA序列，共6939bp，由16个外显子，15个内含子组成，中外显子的大小分别为：100，137，64，113，88，64，87，95，134，73，108，96，143，93，108和99 bp，内含子的大小分别为：146，585，133，68，58，62，725，57，152，49，59，1299，1762，113和66 bp；利用大肠杆菌原核表达Hc-DAF-22蛋白，制备了多克隆抗体；使用real-time PCR技术检测Hc-daf-22的期表达特异性，并通过原位杂交对其进行组织结构定位发现主要集中于虫体的肠道表达；利用秀丽隐杆线虫对其启动子活性进行比较分析，发现H.contortus的启动子可以启动GFP在C. elegans的咽部、分泌细胞及肠道前端、后端表达，但表达强度不强，而C. elegans的启动子可以高强度的在肠道在皮下组织及肠道中均有表达,启动子表达部位与强度的区别可能在于寄生性线虫启动子在C.elegans体内的表达与其在寄生性线虫中的表达部位相关；研究还构建了干扰载体对秀丽隐杆线虫进行RNAi试验，发现干扰后的虫体脂肪沉积增加，出现较大的脂肪颗粒，而将捻转血矛线虫daf-22基因显微注射到C. elegans突变株体内进行拯救后，结果显示虫体脂肪沉积减少，脂肪颗粒减少或者消失，虫体生长的长度和宽度得到明显增加，产卵量也得到明显提高，但是发育并没有得到改善，证明捻转血矛线虫对C. elegans daf-22突变株进行了部分拯救。本研究初步揭示了Hc-daf-22基因的功能，为后续深入研究寄生性线虫滞育形成机制提供了基础。