全组织透明染色结合三维成像技术研究卵巢血管新生在卵泡发育及针刺促排卵中的作用

Unique for the ovary, hormonally regulated folliculogenesis, follicle rupture, luteal formation/regression and associated vasculature changes lead to tissue remodeling during each reproductive cycle. Follicular development and ovulation is the basis of female pregnancy. The process and mechanism of follicular development and ovulation is highly related with local vascular and ovarian periodic reconstruction. In the present study, for the first time, we turn the whole tissue transparent (Clarity), but retain internal fine structure and molecular biological information. Then immune-staining of multi-round specific markers will be used to show 3D imagings obtained by laser scanning confocal microscope. Using the Clarity approach and marker immunostaining, we identified individual follicles and local vasculature network in intact ovaries: (1) to understand vividly the internal vascular network 3D distribution and spatiotemporal principles, blood vessels trends, estrous cycle dynamic, the relationship of angiogenesis and follicular development will be presented; (2) to study the abnormal vascular function in polycystic ovary syndrome (PCOS) – one typical disorder of follicle development and ovulation; (3) illuminate the effects of acupuncture on follicle development and ovulation by regulating angiogenesis of local ovarian vasculature. This study helps to understand the essential roles of vasculature in organizing follicles; promote in vitro and in vivo activation of follicular development; provide the fertility possibility for middle-age women, women with PCOS, premature ovarian failure (POF) and tumor radiotherapy and chemotherapy; develop scientific research and clinical practice of acupuncture in the treatment of anovulatory infertility.

成年卵巢由上千个不同发育阶段的卵泡组成，是正常机体极少数可发生周期性血管新生和重构的器官。卵泡发育及排卵是女性妊娠的基础，其过程和机制可能与卵巢局部的血管新生密切相关。本项目首次通过全组织透明染色技术，将完整卵巢透明化处理但保留组织内部精细的结构和生物信息分子，运用免疫组织化学染色技术对同一组织进行多轮不同抗原的特异性染色，通过激光共聚焦显微镜获取图像数据、计算机软件三维成像分析，直观描绘出（1）卵巢血管的三维空间分布和时空变化规律；阐明卵巢血管新生对卵泡发育和排卵的影响。（2）卵巢血管新生在PCOS卵泡发育和排卵障碍中的可能机制。（3）针刺通过对卵巢血管的调节对卵泡发育和排卵的影响。 这对卵泡发育的基础机制研究；离体或在体促进卵泡发育的临床实践；对大龄女性、PCOS、卵巢早衰及肿瘤放化疗术后有生育要求的女性的残存卵泡激活、发育和针刺治疗排卵障碍型不孕症等提供研究思路和科学依据。

随着生活方式的改变和女性职业化程度的提高，女性婚育年龄不断推后；和因为遗传、环境污染、生活压力等引起的各种生殖疾病逐年增多。卵泡是卵巢的基本功能单位。卵巢是主管女性生长、发育、生殖的重要器官。而卵巢是人体除子宫内膜以外，惟一一个可以发生周期性血管新生、重构的正常组织。针灸作为一种自然疗法，在中国治疗妇科疾病有着悠久历史，且有独特的优势。针刺已经确定可以通过下丘脑—垂体—卵巢轴进行神经内分泌系统的中枢调节，也可以直接作用于卵巢、肾上腺、脂肪等外周组织。临床上对不孕症患者有很好的治疗作用。. 本课题利用组织透明染色及三维成像技术，描绘卵巢血管、神经和卵泡的三维空间分布和时空变化规律，探讨其在电针治疗多囊卵巢综合征的作用。以双氢睾酮颈部皮下缓释8周建立多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS) 动物模型，再对PCOS模型大鼠进行了为期4周的电针干预。与对照组相比，PCOS模型组大鼠出现体重明显增加、无规律动情周期、卵巢多囊样表现、甾体类性激素失调、胰岛素抵抗等生殖和代谢异常表现。PCOS 组卵巢表现为窦状卵泡发育障碍，窦卵泡周围鞘膜层细胞厚度增加，排卵前卵泡和黄体数量较正常对照组减少。此外，PCOS组卵巢门附近和周围单个窦状卵泡的血管神经支配相互联系减少。电针可以降低PCOS组大鼠体重，部分恢复动情周期，改善胰岛素抵抗和甾体类性激素指标，通过一系列可视化的研究揭示：卵泡发育和排卵与卵巢局部血管、固有神经和神经血管的耦合情况关系密切。卵巢中血管的密度、分布及卵泡周围的血管新生异常，可能是窦状卵泡无法成熟和形成排卵的主要原因；电针促进卵巢广泛的血管新生外，对卵泡周围血管重塑、固有神经末梢向卵泡迁移和神经血管耦合增多等，为卵泡提供发育所需的血液、营养和激素；卵巢神经系统的完整性是电针促卵泡和排卵的结构基础。研究结果为针刺“通其经脉、调其气血”、“求子全赖于气血充足”提供了形象、直观的科学依据，采用的方法和研究实践具有典型的示范作用，对中医学现代化发展具有启性。