Kupffer细胞通过TLR4调控组织因子参与急性胰腺炎凝血系统变化的研究

Pancreatic microcirculatory disturbance is the one of the most important causes in the development of acute pancreatitis，especially at this early stage. Tissue factor (TF) the initiator of blood coagulation, is primary from tissue factor-bearing microparticles of mononuclear phagocytes under inflammation. Lipopolysaccharide (LPS) can activate mononuclear phagocytes and promote expression of TF depended on TLR4 pathway. Kupffer cells played a pivotal role in the development of acute pancreatitis and multiple organ dysfunctions is the significant source of TF in liver. However the roles of Kupffer cells in coagulation disorders with acute pancreatitis related to TLR4 mediated tissue factor pathway is still not completely clarified. So in this project，we will take Kupffer cells the mononuclear phagocytes resided in liver as an important research point, establish animal model of acute pancreatitis, constructe plasmid significantly suppresse TLR4, to explore the molecular mechanism of TLR4 mediated tissue factor in Kupffer cells under acute pancreatitis. The objective of this project is to investigate roles of Kupffer cells in coagulation disorders with acute pancreatitis related to TLR4 mediated tissue factor pathway, enriches and perfects the mechanism of Kupffer cells action to acute pancreatitis.

微循环障碍是急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)发病的重要始动因素之一，组织因子(tissue factor，TF)在AP凝血紊乱中起关键的启动作用。炎症状态下LPS可以激活TLR4信号通路致单核细胞高表达TF，TF通过其载体TF相关膜微粒与血小板形成循环并激活凝血系统。Kupffer细胞(KCs)在AP发生中起重要作用，但KCs能否通过TLR4信号通路调节TF表达，调控凝血系统，进而参与AP的微循环障碍目前尚无相关报道。本项目选择体内最大的单核巨噬细胞群KCs为靶细胞、LPS模拟体内炎症对KCs的刺激、以TLR4信号通路调控TF为切入点，建立小鼠AP模型、分离KCs，采用siRNA、流式细胞等实验技术，探讨KCs中TLR4通路调控TF表达的分子机制，阐明KCs通过调控凝血系统在AP微循障碍中的确切作用。

目的：利用LPS模仿体内炎症刺激，探讨KCs在受到LPS刺激时能否释放出TF-MPs，判断阻断TLR4通路能否对KCs表达TF产生调控。方法：分为WT组和TLR4-/-组，WT组为野生型C57小鼠所分离培养的KCs，TLR4-/-组为TLR4-/-小鼠所分离培养的KCs，分别加LPS（300 ng/ml）刺激，ELISA法检测各时间点的培养液上清TF浓度，流式细胞仪检测培养液上清的TF-MPs浓度。Western Blot法检测KCs中TF和TLR4的蛋白表达量；利用Real-time PCR法对KCs内部的TF mRNA、TLR4 mRNA这两项指标的表达水平进行检测。结果：在30 min-120 min的时间点上，WT组小鼠的TF水平均较TLR4-/-组小鼠明显上升，存在明显差异性（P<0.05），WT组：从0 min到120 min，呈逐渐升高趋势；TLR4-/-组：0-60 min时段中，TF均在显著性上升；但在60 min、120 min这两个时段上无明显差异性（P>0.05）。WT组TLR4蛋白表达量从0 min到30 min，呈逐渐上升状态；于30min抵达该表达的峰值；在60 min、120 min这两个时段上，TLR4指标未见明显差异性（P>0.05）。TLR4-/-组未检测到该指标的表达。在不同时间点上，WT组小鼠的TF蛋白表达要比TLR4-/-组小鼠显著上升，相比差异性较大（P<0.05）；WT组：从0 min到30 min，该指标在持续上升，抵达峰值的时间为30 min，在60 min、120 min这两个时段上，其表达水平较为接近（P>0.05）。TLR4-/-组：0-30 min之间，该指标均在持续上升，抵达峰值的时间为30 min，在60 min、120 min这两个时段上，TF蛋白表达水平未见明显差异（P>0.05）。WT组比TLR4-/-组在30 min-120 min时间点TF mRNA水平均在显著上升，存在较强的差异性（P<0.05）。结论：本研究证实敲除TLR4后TF及TF-MPs表达明显受到抑制，TLR4与TF及TF-MPs呈正相关，提示LPS或可利用TLR4这一路径，对KCs细胞内部的TF表达起到调节作用。通过TLR4受体，LPS或可对TLR4通路起到激活作用，促进KCs表达TF，通过TF-MPs而释放TF。