ROP18在新孢子虫和弓形虫致病性差异中的功能分析

Toxoplasma gondii Rhoptry Protein 18(TgROP18) plays a very important role in virulence. TgROP18 directly phosphorylates immunity-related GTPases on the vacuolar membrane and protects the parasite from killing by defense mechanism of the host. Virulent T.gondii strains type I expresses the highest levels of ROP18. As a close relative of Toxoplasma gondii, Neospora caninum has similar morphological structure and biological characteristics, but its virulence is significantly lower than T.gondii. ROP18 maybe the molecular mechanism of virulence difference between them. This project intends to clone and expression, localization of NcROP18 and find its fuction rely on biological fuction, phenotype and virulence by knocked out endogenous NcROP18 and transfected TgROP18 to N.caninum. Try to find out whether ROP18 is the important factor of N.caninum and T.gondii virulence differences.To explore the molecular mechanism of N.caninum and T.gondii differences in pathogenicity.

弓形虫棒状体蛋白18（TgROP18）通过磷酸化宿主细胞的免疫相关GTPase逃避宿主免疫杀伤机制，是弓形虫的重要毒力因子，毒力最强的Ⅰ型虫株ROP18的表达量最高。新孢子虫与弓形虫的形态结构及生物学特性相似，但毒力差异较大，ROP18可能是导致二者毒力差异的重要分子基础。本项目拟借助TgROP18的生物学信息对新孢子虫棒状体蛋白18(NcROP18)进行克隆、表达、定位和功能研究，通过敲除新孢子虫内源性ROP18及转入TgROP18比较分析NcROP18与TgROP18生物学功能，研究转基因新孢子虫表型和毒力的改变。探讨ROP18是否为新孢子虫与弓形虫毒力差异的重要因子，为新孢子虫和弓形虫致病性差异的分子机制提供依据。

弓形虫（T. gondii）和新孢子虫（N. caninum）都是专性细胞内寄生原虫，二者在形态学特征和生物学特性上有许多相似之处，但是它们对小鼠的急性毒力却存在显著差异。本研究通过生物信息学分析发现新孢子虫棒状体蛋白18（NcROP18）的基因序列中插入了多个终止密码子，不能表达相应的功能蛋白，是假基因。因此推测弓形虫与新孢子虫ROP18的差异可能是导致它们急性毒力差异的重要因素。将弓形虫RH株的TgROP18定向克隆至pDMG表达载体，构建pDMG-TgROP18过表达质粒并转染新孢子虫，获得表达TgROP18的转基因新孢子虫Nc-TgROP18单克隆虫株。通过细胞培养观察、噬斑实验、运动实验、滑移实验、细胞入侵实验及细胞内增殖实验，对转基因新孢子虫和新孢子虫Nc1株及弓形虫RH的表型进行比较研究。结果显示转基因新孢子虫在细胞内的增殖能力较新孢子虫Nc1株增强，但在虫体运动、滑行、微线蛋白分泌水平及入侵宿主细胞的能力没有太大差异。小鼠毒力实验表明，转基因新孢子虫与Nc1相比对小鼠的毒力增强，说明转基因表达的TgROP18可以显著增强新孢子虫的毒力。为了进一步研究转基因新孢子虫毒力增强的分子机制，进行了IRGs募集实验和磷酸化检测，结果表明转基因新孢子虫通过TgROP18的磷酸化作用阻止IRGs向其纳虫空泡膜募集，以抵抗宿主细胞的免疫杀伤作用，从而导致其对宿主的毒力增强。本研究首次对弓形虫与新孢子虫毒力差异的分子机制进行了探索研究，确定了ROP18是弓形虫与新孢子虫毒力差异的重要因子。