泛素-蛋白酶体抑制剂通过调变肿瘤间质和内皮细胞基底微绒毛阻断胰腺癌早期微转移

It has been reported recently that the stroma of pancreatic cancer plays a protective role in preventing tumor metastasis, which happens in the early stage of tumorigenesis; also we discovered the existence of basal microvilli on the microvasculature that may mediate early tumor micrometastasis. Thus we hypothesize that early tumor micrometastasis could be prevented by enhancing the protective fuction of tumor stroma. In our early study we found that the ubiquitin-proteasome system (UPS) inhibitor MLN4924 increased the Gli1 level and promoted proliferation of pancreatic stellate cells; MLN4924 also inhibited the growth of microvilli in the rat aorta model. Firstly we will investigate the effects of MLN4924 on the stroma and vasculature of pancreatic cancer in vitro, the underlying mechanisms and the roles of key proteins as Gli1 and REDD1; then using an orthotopic pancreatic cancer model we will monitor the circulating tumor cells and liver metastasis dynamicly to evaluate the early dissemination of tumor cells, thus verify the effects of MLN4924 to enhance tumor stroma and inhibit endothelial microvilli, and assess the clinical potential of MLN4924 to prevent early metastasis and increase the survival of pancreatic cancer patients. This project will also improve our understanding about the mechanisms of UPS inhibitors.

近期研究发现胰腺癌在成瘤过程早期即发生转移，但胰腺癌的间质具备阻止癌细胞转移的保护性作用，同时我们首次发现胰腺癌中存在的内皮细胞基底微绒毛或介导早期微转移的发生，因此我们假设通过增强胰腺癌间质的保护作用、抑制血管微绒毛来抑制早期微转移的发生。我们的前期工作发现泛素-蛋白酶体系统（UPS）抑制剂MLN4924可提高胰腺星形细胞中Gli1的水平，促进其增殖；在大鼠主动脉内皮模型上并可抑制血管微突起的生长。本课题拟首先通过细胞实验进一步研究MLN4924对胰腺癌间质和血管新生的影响，以及与关键蛋白Gli1和REDD1的关系及作用机制；通过监测原位胰腺癌模型的循环肿瘤细胞和肝脏转移灶评估早期微转移的情况，验证MLN4924促进胰腺癌间质、抑制内皮细胞基底微绒毛的作用，评估MLN4924减少胰腺癌的早期微转移、提高生存期的潜在应用价值。本研究也有助于对UPS抑制剂的作用机制的理解。

MLN4924能够抑制Cullin-RING泛素连接酶底物的蛋白水解，对包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤具有抗肿瘤作用。MLN4924通过改变细胞内多种关键调节蛋白来抑制肿瘤的生长，但其对胰腺癌的基因表达谱以及肿瘤间质的影响仍不清楚。在本研究中，我们通过基因芯片分析和IPA分析测定MLN4924所导致的胰腺癌基因表达变化。通过RNAi技术评估筛选出的基因对胰腺癌增殖和凋亡的影响。应用胰腺星形细胞和人微血管内皮细胞（HMEC-1）研究MLN4924对胰腺癌间质的影响。MLN4924处理胰腺癌细胞后，11个通路发生显著改变（5个被激活、6个被抑制），45个功能发生显著变化（21个被激活、24个被抑制），预测最显著激活的上游因子是TNF。在691个差异表达基因中，通过实时定量PCR和高内涵筛选测定，发现敲减NAPEPLD与MLN4924具有协同作用。在体外实验中，NAPEPLD敲减能够增强MLN4924对胰腺癌增殖的抑制效果并诱发凋亡。在胰腺癌裸鼠模型中，相比于对照组，MLN4924能够更加显著的抑制NAPEPLD敲减组肿瘤的生长。相比于正常胰腺组织，NAPEPLD在胰腺癌组织中呈现高表达，但与患者预后并无相关性。我们发现MLN4924能够抑制胰腺星形细胞的增殖和其分泌胶原蛋白，但能够促进其分泌CXCL-1和MCP-1，且这种现象能够被Shh抑制剂GANT61部分逆转。MLN4924作后胰腺星形细胞中转录因子Gli1的含量下降，而以MLN4924作用于Gli1敲减的细胞，其胶原蛋白分泌的下降水平与以MLN4924作用的对照细胞以及未用药物处理的Gli1敲减的细胞相当。MLN4924能够抑制HMEC-1细胞的多种血管生成表型，而低氧环境和mTOR激动剂能够部分缓解MLN4924对HMEC-1细胞的抑制作用。MLN4924作用后细胞内REDD1水平下降，且REDD1敲减能够抑制HMEC-1细胞的血管生成表型。综上，我们的研究结果提示MLN4924能够引起胰腺癌细胞发生广泛的基因表达改变，靶向抑制NAPEPLD可能增敏MLN4924的药效，并证明了MLN4924能引起胰腺癌广泛的间质重塑作用，其抑制间质和血管生成作用分别与Gli1和REDD1有关。本课题拓展了对MLN4924对胰腺癌作用效果和机制的认识，为进一步扩展MLN4924在胰腺癌中的应用、增敏MLN4924效果提供了依据。