SIRT1诱导VSMC自噬在动脉粥样硬化中的作用和分子机制研究

It is well known that atherosclerosis, resulting into vascular stenosis or occlusion, is an important etiology and risk factor for cerebrovascular diseases. Vascular smooth muscle cell (VSMC) is involved in the whole process of atherosclerosis development. It was found that activating SIRT1 (Sirtuin1) improved secretion, migration and lipid uptake of VSMC in atherosclerosis in our previous research and preliminary experiments. However, the other effects of phenotypic modulation (proliferation, typical protein expression) by activating SIRT1 on VSMC and underlying mechanisms are not clear. Our team during my doctoral studies found that autophagy was a protective mechanism against VSMC impairment in atherosclerosis lesions. We will explore the effect and underlying mechanisms of VSMC autophagy induced by SIRT1 in atherosclerosis based on our previous results. We plan to illuminate the effects and mechanisms of the SIRT1 on the VSMC autophagy, and then explore the effects of the autophagy on VMSC phenotypic modulation and VSMC-derived foam cell formation, using cellular and molecular biological methods. Finally, we will explore the effects of autophagy induced by SIRT1 on the development of intracranial and extracranial atherosclerosis using morphologic examination of gene knockout mice. The results of this project can provide new ideas and methods for attenuating the development of atherosclerosis.

动脉粥样硬化（AS）易造成血管狭窄甚至闭塞，是脑血管病的重要病因及危险因素。血管平滑肌细胞（VSMC）是参与AS发生发展全过程的重要细胞成分，我们前期的研究结果以及预实验结果显示激活SIRT1能够改善AS中VSMC受影响的分泌、迁移以及脂质摄取等部分功能，而对其他如表型转化（增殖、特征蛋白表达）等功能的影响以及涉及哪些信号途径，目前并不完全清楚。申请人博士期间所在的课题组发现自噬对AS病变中的VSMC有保护作用。本项目在前期的工作基础上，以VSMC自噬为切入点，继续探讨SIRT1在AS中的作用和分子机制。本项目拟利用细胞及分子生物学等手段阐明SIRT1对VSMC自噬的作用，并探讨自噬对VSMC表型转化和泡沫样变的影响，并揭示其中的信号调控途径；进一步利用基因敲除动物形态学实验探讨SIRT1通过调控自噬对颅内外AS进展的影响。本研究结果可为干预AS进展提供新的思路和方法。

动脉粥样硬化易造成血管狭窄甚至闭塞，是脑血管疾病的重要病因及危险因素。血管平滑肌细胞（VSMC）是参与动脉粥样硬化发生发展全过程的重要细胞成分，其功能改变分子机制及防控策略是我们探索研究的重点。研究中我们发现用80μg/mL的氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）诱导VSMC泡沫化时，LC3-II/I、beclin1、Atg5和Atg7的mRNA和蛋白表达降低，p62表达增加，提示细胞自噬受到抑制。以细胞自噬为切入点，我们探讨去乙酰化酶1（SIRT1）在影响动脉粥样硬化VSMC功能改变的分子机制。通过基因工程和药物干预SIRT1的表达，Bodipy染色检测细胞内的脂质沉积结果显示SIRT1过表达组和SIRT1激动剂SRT1720组可成功逆转自噬相应蛋白的表达变化，且细胞内脂质含量相对于对照组降低，提示激活SIRT1可以增强由oxLDL削弱的细胞自噬水平，而抑制VSMC泡沫细胞内脂质沉积。溶酶体相关膜蛋白（LAMP）1被广泛应用到检测自噬溶酶体的活性实验中。实验发现激活SIRT1可以增加LAMP1的表达，而抑制SIRT1后则可以减弱该作用，提示溶酶体途径可能参与到了SIRT1激活对VSMC自噬水平的提高和泡沫化的抑制作用中。同时发现SIRT1过表达可以增加腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平，而敲低SIRT1后p-AMPK表达减少，提示激活SIRT1可以促进AMPK活化。我们利用AMPK的抑制剂Compound C抑制AMPK的活性，结果显示AMPK的抑制剂Compound C可以抑制p-AMPK和自噬相关蛋白（Atg7和LC3）的表达。研究结果提示SIRT1通过活化AMPK和激活溶酶体途径增强VSMC泡沫化过程中的自噬水平。利用siRNA-Atg7干扰Atg7合成后，发现LC3、beclin1以及Atg5表达下降，p62表达增加，提示siRNA-Atg7有效敲低Atg7后可起到抑制细胞自噬的作用。当加入SIRT1激活剂或抑制剂后可有效影响自噬，可见激活SIRT1可以增强细胞自噬水平；但是据实验结果所示即使敲低自噬相关Atg7，SIRT1仍然可以发挥作用，提示自噬并非SIRT1影响VSMC泡沫样变的唯一途径。进一步探索发现，SIRT1可以通过激活PPARγ/ABCG1调控胆固醇逆转运，亦可以通过抑制经典的NF-κB炎症信号通路而抑制VSMC源性泡沫细胞形成。