宿主细胞跨膜蛋白基因FAM176A对乙型肝炎病毒复制调控的机制研究

So far,the host defense factors against HBV replication remain unclear. From our previous study, we analyzed 83 chronic hepatitis B virus infected patients by Affymetrix GeneChip arrays and found that the expression level of FAM176A gene in inactive carrier patients was significantly higher than in the immune tolerance patients, which was inversely associated with the level of serum HBV DNA.In vitro study showed that overexpress of FAM176A gene could significantly inhibit HBV replication, while knockdown of FAM176A gene could upregulate HBV replication, the mechanism is still unknown. We hypothesize that FAM176A can influence HBV replication through the regulation of liver cell autophagy function. This project will also verify whether FAM176A could inhibit HBV replication in liver cancer cell lines or high-pressure tail vein injection mouse model and whether the FAM176A expression level has a correlation with viral load or cell autophagy in the liver tissue of chronic hepatitis B virus infected patients. This study will help to uncover the new mechanism that host factor can control HBV replication..

目前，宿主控制HBV复制的机制尚未完全清楚。在我们的前期工作中，采用Affymetrix RNA芯片，分析了83例慢性HBV感染患者肝组织的基因表达谱，首次发现FAM176A基因在非活动期患者肝组织内的表达水平明显高于免疫耐受期患者，并与血清HBV DNA水平呈负相关。在体外实验中，过表达FAM176A可显著抑制HBV的复制，而沉默该基因后可上调HBV复制，但其机制尚不清楚。我们推测，FAM176A有可能通过调节肝细胞的自噬功能而影响HBV的复制。本课题拟在肝癌细胞系和高压尾静脉注射建立的小鼠慢性HBV感染模型中验证FAM176A对HBV复制的抑制作用，了解该抑制作用是否通过调节肝细胞的自噬功能而实现，并在不同临床类型的慢性HBV感染患者肝组织中，验证其表达水平是否和病毒载量以及细胞自噬相关，以阐明肝细胞内FAM176A抑制HBV复制的机制。本研究有助于揭示宿主基因控制HBV复制的新机制。

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国及全球性的一项重大公共卫生问题，清除HBV，是临床治疗慢性乙型肝炎的目标。前期研究发现宿主肝组织基因编码蛋白FAM176A能在体外实验中抑制HBV复制。本研究阐明了FAM176A对HBV复制的影响作用，及其相关机制。申请人圆满的完成了任务书的内容，取得的主要成果如下：1）明确FAM176A能抑制HBV复制。在肝癌细胞系中，过表达FAM176A后， HBV复制过程产物RNA、DNA及HBV蛋白S蛋白、核心蛋白、细胞上清中HBsAg和HBeAg均明显下降，且呈剂量依赖性。敲减FAM176A后，HBV病毒核酸及表达蛋白均增加，提示抑制FAM176A能增强HBV复制。在HepG2-NTCP感染系统中，FAM176A过表达会抑制HBV基因表达。证实体外实验中，FAM176A能抑制HBV复制。在C3H/HeN小鼠中，通过高压尾静脉注射HBV质粒和小鼠Fam176a质粒，观察注射后8周小鼠血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg，结果显示Fam176a组小鼠血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg均明显下降，证明动物体内实验中，FAM176A能抑制HBV复制。2）证实跨膜区是FAM176A抑制HBV复制的关键功能域。研究预测了FAM176A蛋白二级结构，预测结果显示FAM176A蛋白有4个α螺旋和1个跨膜区。构建不同α螺旋或跨膜区缺失的FAM176A截短体，在肝癌细胞系中，观察其对HBV病毒核酸和表达蛋白的影响。结果显示跨膜区缺失的FAM176A截短体对HBV复制的抑制作用明显减弱。证实跨膜区是FAM176A抑制HBV复制的关键功能域，为抗HBV新药开发提供了新的靶点。3）探索了FAM176A抑制HBV复制的机制。本研究发现FAM176A能促进LC3点状分布增多，且能促进LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，提示FAM176A能诱导自噬体形成。研究显示FMA176A能通过自噬促进HBV核心蛋白降解，加用溶酶体抑制剂CQ后，HBV核心蛋白量会部分恢复。FAM176A能使mRFP-GFP-LC3荧光红色点增多，提示FAM176A能增强溶酶体活性。上述结果提示FAM176A能通过自噬溶酶体途径部分降解HBV核心蛋白，从而抑制HBV复制。这为开发HBV感染控制方法提供了新的理论依据。