绵羊胚胎发育中Brachyury基因的突变表达与呼伦贝尔短尾羊“短尾征”关系研究

Brachyury is the founder member of the T-box family of transcription factors, which is characterized by a DNA-binding domain of approximately 200 amino acids. The Brachyury gene play an important role in early vertebrate development. Mice that are heterozygous for the Brachyury mutation have a short tail, while homozygous mutant embryos die lacking a notochord and structures posterior. Our.study confirmed that the Brachyury gene located in the selection region of short-tailed by Whole Genome Resequencing for Hulun Buir short tailed sheep. Compared with the normal sheep, have a single nucleotide site mutation in the brachyury gene.At present, a detailed study of Bracyury in sheep has not been reported. In order to clarify the mechanism of the mutational Brachyury gene caused short-tailed phenotypes in Hulun Buir short tailed sheep, we will investigate the relationship between the mutational Brachyury gene and the reason of short-tailed phenotypes in the sheep by molecular biology, information science, histones, chromatin immunoprecipitation technology and preparation of transgenic animals (sheep). All of these will provide a theoretical basis for study of the short-tailed animals and breeding of short tailed low-fat sheep.

Brachyury基因是T-box家族中最早被发现的转录因子，含有一个200个氨基酸左右的结合域。该基因在早期的脊椎发育过程中起着重要的作用。鼠Brachyury基因杂合性突变导致短尾畸形，纯合性突变导致无法形成脊椎及后续的体节而造成胚胎宫内死亡。我们通过基因组重测序分析了呼伦贝尔短尾羊，并发现Brachyury基因位于短尾性状受选择的区域。与正常其他绵羊比较，Brachyury基因发生了单核苷酸位点突变。目前，在绵羊上进行Brachyury基因研究未见报道。本项目通过分子生物学、生物信息学、蛋白组学、染色质免疫共沉淀技术及制备突变基因动物（绵羊）的方式从功能上说明Brachyury基因的突变与产生绵羊“短尾征”的关系。阐明呼伦贝尔短尾羊上发生Brachyury基因突变而引起“短尾征”出现的机制，为今后短尾动物的研究及短尾低脂绵羊的选育提供理论基础。

通过分子生物学、生物信息学、蛋白组学研究方法，从功能上论证Brachyury基因的突变与产生绵羊“短尾征”的关系。阐明呼伦贝尔短尾羊上发生Brachyury基因突变而引起“短尾征”出现的机制，为今后短尾动物的研究及短尾低脂绵羊的选育提供理论基础。.呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因出现两处突变位点c.G333C与c.G334T 的纯合子和杂合子。是造成呼伦贝尔短尾羊短尾特征的主要因素。应用Smart RACE方法，成功克隆了T/Brachyury基因的cDNA ，cDNA长度为2426 bp，其中3’UTR、3’ploy（A）尾和5’UTR分别为763bp和328 bp；CDS（蛋白质编码区）为1335bp；将T/Brachyury 基因完整CDS成功连接至pEASY®-BluntE1表达载体，成功实现原核表达BRACHYURY蛋白，并制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体，抗体效价达1：1500，该抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的BRACHYURY蛋白；16天胚胎草原短尾羊胚胎中BRACHYURY蛋白表达量最高。.建立了基于非标记探针高分辨率溶解曲线的呼伦贝尔短尾羊鉴定方法，并应用于短尾羊群的基因分型，获得呼伦贝尔短尾羊核心群体（1470只）。.分析乌珠穆沁羊、呼伦贝尔短尾羊16天胚胎转录组水平差异，共鉴定出2152个差异表达基因。差异表达基因包括WNT5A、WNT2、AXIN2、BMP5、TGFB2和SMAD9，这些差异表达基因参与多种信号通路，包括参与消化吸收和细胞分化的基因，如DPP4、ACE2、PLPP1、CD22、CD44、TEC和JAK1等。.Brachyury受到BMP信号通路转导因子Smad1、Smad5和Smad8等基因的调控，进而影响SOX9的转录表达，Brachyury通过负反馈调节机制影响BMP2基因的表达，他们共同影响小鼠早期胚胎发育。同样是T / Brachyury 基因突变调控短尾羊特征的作用机制。