HGF+Bcl-2+BMMSC移植对小鼠急性肝功能衰竭的治疗作用及其调控机制的研究

The present application is aimed to determine a therapeutic potential and regulatory mechanism of HGF+Bcl-2+BMMSC transplant in acute liver failure using an established mouse model of hhepatic toxicity. Slow virus vectors expressing pHGF-GFP(pHGF-GFP-v) and pBcl-2-RFP(pBcl-2-RFP-v) will be genetically engineered by DNA point mutation and high preservation synthesis. Cultured donor BMMSCs will be transinfectedwith these viruses to establish stalbe cell lines coexpressing pHGF, pBcl-2 and the fluorescent reporter. The effect of HGF+Bcl-2+BMMSC in hepatic regeneration and functional recovery will be determined by histological and biochemical tests following transplant of the genetically modified cells into acute liver failure model of BALB/c mice. By using specific agonists and antagonists, we will also determine the regulatory role of Notch and Wnt signal pathway during the transdifferentiation of HGF+Bcl-2+BMMSCs into hepatocytes in vivo. The proposed studies may provide strong experimental evidence supporting a therapeutic utility of transplantation with genetically improved BMMSCs in the management of degenerative liver diseases.

本课题拟采用DNA点突变及DNA直接合成的方法高保真构建特异性启动子报告基因慢病毒载体pHGF-GFP-v及pBcl-2-RFP-v，采取先后分别转染的策略将pHGF-GFP-v载体及pBcl-2-RFP-v载体依次进行骨髓间充质干细胞的稳定转染，并进行传代扩增培养，经流式细胞仪筛选同时携带HGF及Bcl-2的骨髓间充质干细胞，然后移植到BALB/c小鼠急性肝脏功能衰竭模型当中，阐明携带外源基因HGF及Bcl-2的骨髓间充质干细胞对急性肝功能衰竭具有显著的治疗作用；另外，在细胞水平，凭借transwell共培养体系，通过应用Notch源基因HGF及Bcl-2的骨髓间充质干细胞转分化为肝细胞的过程中所发挥的调控机制及其规律，为促进基因改良干细胞移植治疗肝脏疾病奠定实验基础。

背景与目的：肝硬化是由一种或者多种病因长期反复作用形成的弥漫性肝损害。其中我国肝硬化最常见的病因为病毒性肝炎。目前肝硬化主要治疗方案为保护肝功、防止并发症等支持对症治疗，但疗效不显著。肝移植对于肝硬化患者而言，是最有效的治疗方法， Hgf及Bcl-2基因修饰的BMSCs作为肝硬化的新兴治疗手段，其治疗潜能非常巨大。与单纯的干细胞移植或基因治疗相比，其安全性更高，更具有优势。本研究采用了Hgf及Bcl-2基因修饰的BMSCs治疗肝硬化大鼠模型，并探讨Hgf及Bcl-2基因对肝硬化的影响。.方法：将肝硬化的大鼠模型分为4组，各组均进行尾静脉注射处理：（生理盐水组，n=16；BMSCs组，n=16；Hgf及Bcl-2组，n=16；Hgf及Bcl-2基因修饰的BMSCs，n=16），在各组处理第7天、第14天、第21天、第28天后处死大鼠，并取静脉血与肝组织，进行生化检验；采用Western Blot法检测ALB、CK18及，HNF-4α；对肝组织进行H-E染色、免疫组化及免疫荧光检测，探讨Hgf及Bcl-2、BMSCs移植对肝硬化的治疗效果。.结果：相对于对照组，Hgf及Bcl-2组、BMSCs组、BMSCs + Hgf/Bcl-2组的静脉血中ALT、AST、ALB、TBIL 水平均有改善，且 BMSCs +Bcl-2组的改善最为明显（P<0.05）；Western Blot结果显示，三组蛋白中，对照组表达最低，而在其他各治疗组中蛋白均表达增加，且BMSCs +Bcl-2组的蛋白表达水平最高（P<0.05）；免疫组化结果显示，各治疗组均比对照组蛋白表达水平高，且BMSCs + Hgf/Bcl-2组蛋白表达水平最高（P<0.05）；免疫荧光显示 BMSCs + Hgf/Bcl-2组的荧光表达呈阳性，在其他三组中荧光表达均呈阴性。.结论： 1、Hgf/Bcl-2+BMSCs移植治疗能改善CCL4致大鼠肝硬化后的肝脏功能，并能提高肝脏的蛋白表达水平。.2、携带Hgf/Bcl-2基因的BMSCs移植可以减缓肝硬化的进展，并改善肝脏的功能，3、Hgf/Bcl-2+BMSCs移植治疗明显优于单纯 BMSCs移植肝硬化疾病效果。