刺参池塘养殖过程中环境细菌群落的演替规律及其调控

针对我国目前刺参池塘养殖环境恶化、病害频发、基础研究薄弱等问题。拟以养殖环境细菌群落为切入点，采用培养法和分子生态学技术相结合、室内实验与现场试验相结合的手段，研究刺参池塘养殖过程中，不同时间段和刺参不同健康状态下环境中总细菌多样性和种类组成、参与氮和硫等元素物质循环的细菌的多样性、不同生理类群细菌的数量以及已知刺参病原菌的种类和数量等方面的变化，并通过人为调控实验，探索环境调控对发病状态下细菌群落结构的优化作用及机理，以期揭示刺参正常养殖过程中环境细菌群落结构特征的演替规律，发现刺参发病前后环境细菌群落结构的差异，并找到优化刺参池塘养殖环境细菌群落结构的可能途径，从而为从环境微生物学角度解释刺参发病原因及通过人为构建健康刺参养殖生态系统达到防病目的提供理论依据和技术支撑，对促进刺参养殖业可持续发展和推动海水环境养殖微生物学的学科发展具有重要理论和现实意义。

通过对刺参池塘进行周年现场监测、采样及采用克隆文构建、DGGE、高通量测序等方法，研究了其环境理化指标、细菌类群、细菌群落的演替规律及其相关关系；通过分析不同发病情况发病池和未发病池及同一池塘发病前后细菌群落结构的差异，确定了环境细菌群落结构与刺参发病的关系，分离筛选了有益菌，并建立了群落结构快速分析技术及有益菌和病原菌快速定量检测方法，为刺参疾病防控提供了可靠依据。主要结果如下：.1.刺参正常养殖过程中水体pH和溶解氧与温度变化趋势相反，均在夏季出现最低值；沉积物pH与氧化还原电位呈显著正相关，与硫化物含量均呈极显著负相关。水中大多数细菌类群的周年变化呈夏季高、冬季低的趋势，弧菌变化幅度较异养菌大；硝化细菌较硫化细菌高一个数量级；沉积物中弧菌数量在夏季和冬季出现两个高值；氮循环相关细菌的数量高于硫循环相关细菌；总异养菌、硫酸盐还原菌和硝化细菌含量与硫化物量均呈极显著正相关，硫化菌和硝酸盐还原菌与之呈显著负相关，硝化细菌与总氮含量正相关性显著。总异养菌和弧菌与与硝化细菌、硫酸盐还原菌之间、硝化细菌与硫酸盐还原菌之间均存在极显著正相关性。 .2. 刺参发病时，一类发病池呈温度高、盐度骤降、盐度跃层、溶解氧波动大，且沉积物有明显臭味等特点。另一类池发病当日总异养菌和弧菌数量明显增多，其他菌类和理化因子正常，因此推断理化环境突变和弧菌类是导致刺参发病主要原因。.3. 高通量测序结果显示， 刺参养殖环境细菌优势菌分别属于绿弯菌门、变形菌门及厚壁菌门，变形菌门为绝对优势种，占丰度70%。不同池塘相同时期的沉积物样品，细菌群落结构差异不大，但随时间呈不可逆演变的规律。正常池塘的样品中均含有乳酸菌，发病池则未发现。.4. 在制备DGGEmarker的基础上，建立了刺参养殖池塘细菌群落结构快速分析方法；针对沉积环境中的气单胞菌和副溶血弧菌两种致病菌和水体中盐单胞菌，建立了特异性荧光定量PCR方法。.5. 加入底质改良剂后，发病刺参池塘沉积环境中的总异养菌、硝化细菌、硫酸盐还原细菌等的数量在前2–4 d有所上升，之后降至加改良剂之前菌量；加入底质改良剂第2天，弧菌、硫化细菌和气单胞菌属两种细菌数量便迅速下降，明显低于对照组。表明底质改良剂可改变沉积环境中不同细菌类群的数量，降低致病菌的数量，从而对刺参“腐皮综合征”起到防治作用