tPA对静脉血栓后管壁纤维化重塑的调控作用与机制研究

Venous wall fibrosis remodeling after deep vein thrombosis (DVT) is the main pathogenesis of post thrombotic syndromes (PTS), which featured as the smooth muscle cell (SMC) proliferation and extracellular matrix fibrosis in the vein wall. Our former research showed that tissue-type plasminogen activator (tPA) might be involved in vein wall remodeling regulation after DVT. So in this research, firstly, we will study SMC cell cycle and collagen changes under stimulation of tPA in vitro, in order to test tPA playing an important role in vein wall fibrosis remodeling after DVT by facilitating SMC proliferation and extracellular matrix fibrosis. Secondary, taking fibrosis-related signaling pathways GSK3β as a research point, we research the potential signal pathway mechanism of tPA by the way of exogenous disturbance (tPA over-expression and GSK3β inhibitors). Finally, after successful establishment of tPA overexpression DVT model, we observe the change of SMC proliferation, collagen content and GSK3β expression in vein wall. We look forward to confirm that tPA regulate SMC synthetic phase transition, SMC proliferation and collagen synthesis by the GSK3β signal pathway conduction, which leading to the development of the vein wall fibrosis remodeling. The purpose of the research is not only to reveal the role and mechanism of tPA in vein wall remodeling after DVT, but also to provide clues for molecular targeted therapy for PTS in the future.

管壁纤维化重塑是深静脉血栓形成后综合征(PTS)的发病机制研究热点之一，以管壁平滑肌细胞(SMC)增殖和胶原沉积为主要特征。本项目在前期发现组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与PTS管壁重塑密切相关的基础上，首先以tPA刺激SMC，观察细胞周期和胶原蛋白变化，证明tPA通过促进SMC增殖和胶原合成在PTS管壁重塑中发挥重要作用。其次，将tPA 可能下游信号通路GSK3β作为研究切入点，通过外源性干扰方法(tPA过表达和GSK3β抑制)，研究tPA促管壁纤维化的主要分子机制。最后，通过建立静脉血栓tPA过表达模型，观察管壁SMC增殖状态，胶原蛋白含量和GSK3β表达情况，体内验证tPA通过GSK3β信号通路传导，调控SMC向合成期转变，促进SMC增殖和胶原蛋白合成增加，最终导致管壁纤维化发展。在阐明tPA调控静脉血栓后管壁重塑具体机制的同时，为将来靶向干预、治疗PTS管壁纤维化改变提供理论依据。

深静脉血栓形成后管壁重塑是静脉血栓后遗症的主要病理改变，包括管壁纤维化和平滑肌细胞表型转变。本研究的目的是阐述tPA调控静脉血栓后管壁重塑的具体机制，同时探索相关信号通路GSK3β在其中的关键性作用。首先以tPA刺激SMC，观察细胞周期和胶原蛋白变化，证明tPA通过促进SMC增殖和胶原合成在PTS管壁重塑中发挥重要作用。其次，将tPA 可能下游信号通路GSK3β作为研究切入点，通过外源性干扰方法(tPA过表达和GSK3β抑制)，研究tPA促管壁纤维化的主要分子机制。最后，通过建立静脉血栓tPA过表达模型，观察管壁SMC增殖状态，胶原蛋白含量和GSK3β表达情况，体内验证tPA通过GSK3β信号通路传导，调控SMC向合成期转变，促进SMC增殖和胶原蛋白合成增加，最终导致管壁纤维化发展。结果表明：以tPA刺激SMC 后1小时，S期的SMC比例和周期蛋白D1表达均显著增加；随着tPA浓度的增加，SMC增殖逐渐增强，呈剂量依赖关系。胶原蛋白Ⅰ分子表达在mRNA和蛋白水平变化与tPA刺激均呈剂量和时间依赖关系。tPA刺激SMC后GSK3β活性形式表达明显增强，峰值分别出现在15min和240min；同时上游重要信号分子phospho-AKT和phospho-ERK1/2表达也见增强，最高峰值出现在15min。使用PI3K/AKT抑制剂预处理SMC后下游信号分子GSK3β表达明显下降，同时伴有细胞周期蛋白D1和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平的下降，使用MER/ERK抑制剂预处理SMC后下游通路GSK3β表达稍有下降，同时伴有细胞周期蛋白D1和胶原蛋白Ⅰ蛋白水平的显著下降。但是，加入LY294002和U0126预处理SMC后，胶原蛋白ⅠmRNA水平变化不明显。动物模型造模后7天，中膜细胞核数量大量上升，内膜-中膜厚度稍有增加。造模后14天，中膜细胞核数量显著增多，并伴有内膜-中膜厚度明显增加。与对照组相比胶原纤维含量在造模后7天稍有下降，但是在14天时却显著增多。胶原蛋白Ⅰ在造模后7天和14天均有升高，其中在造模后7天的变化有统计学意义。综合上述结果表明：tPA具有促进SMC增殖和胶原蛋白Ⅰ合成的重要调控作用。tPA以细胞因子的形式，通过AKT-GSK3β信号通路和ERK-GSK3β信号通路共同促进SMC增殖和胶原蛋白Ⅰ合成，其中又以AKT-GSK3β信号通路的作用更为主要。