miR-585/218-2基因簇通过调控MITF的蛋白表达和磷酸化抑制胃癌转移

MiRNAs play an important role in the metastasis of gastric cancer. We found that both miR-585 and miR-218-2 were located in the intron of the Slit3 gene to form miR-585/218-2 gene cluster, and the expressions of which were downregulated in gastric cancer cells with high metastatic potential. Upregulation of miR-585/218-2 expression inhibits gastric cancer metastasis, yet the mechanism remains unclear. According to the results of bioinformatics analyses and preliminary experiment, we put forward the hypothesis that miR-585/218-2 gene cluster inhibits gastric cancer metastasis by regulating the expression and phosphorylation of MITF protein. This project will further identify the promoter-sharing and co-transcription of miR-585/218-2 gene cluster through knocking out the Slit3 gene promoter using CRISPR/Cas9 technology; discover the fact that miR-585/218-2 inhibits MITF expression through suppressing MITF upstream transcription factor CREB and MITF translation, and inhibits MITF activation through suppressing MITF upstream phosphorylation factor MAPK1, thus inhibiting the metastasis of gastric cancer. This study will provide a theoretical foundation for designing and developing new drugs targeting miR-585/218-2 gene cluster to treat gastric cancer.

miRNAs在胃癌转移中起重要作用。我们发现miR-585与miR-218-2均位于Slit3基因的内含子，形成miR-585/218-2基因簇。其编码的miR-585-5p和miR-218-5p在高转移胃癌细胞中低表达，上调其表达抑制胃癌转移。然而miR-585/218-2基因簇作用机制不明，簇成员间作用关系不清。根据生物信息学分析及预实验结果，我们提出了miR-585/218-2基因簇通过调控MITF蛋白表达和磷酸化抑制胃癌转移的理论假设。本项目利用CRISPR/Cas9技术研究miR-585/218-2基因簇共转录；用细胞转染、报告基因、功能挽救等实验研究miR-585/218-2基因簇通过抑制MITF上游转录因子CREB及其本身抑制表达，通过抑制MITF上游磷酸化因子MAPK1抑制活化，从而抑制胃癌转移，为针对miR-585/218-2基因簇开发新的分子靶向药物提供理论依据。

miRNA在胃癌的发展中起着至关重要的作用。在前期研究中我们发现miR-218-5p可抑制胃癌的转移和侵袭，但与其编码来自同一基因上的miR-585-5p在胃癌中的作用不明。本研究发现miR-585-5p在胃癌组织中的表达下调，且miR-585-5p低表达与患者不良预后显著相关。体内外的功能实验表明miR-585-5p在胃癌中具有显著的抗肿瘤增殖和转移能力。生物信息学提示CREB1、MAPK1和MITF可能是miR-585-5p作用的潜在靶标。为了进一步阐明miR-585-5p在胃癌中所介导的抗肿瘤机制，我们提出以下假设：miR-585-5p通过综合调控CREB1/MAPK1/MITF互作网络抑制胃癌细胞的增殖和转移。然后从以下三个方面开展本课题的研究：1.miR-585-5p直接抑制MITF表达的研究。结果发现MITF在胃癌组织中上调，而且MITF的过表达可促进胃癌细胞的增殖、转移和侵袭，降低可抑制这种趋势。miR-585-5p通过结合MITF的3'UTR抑制其转录和蛋白水平。细胞功能拮抗实验表明转染MITF（△3'UTR）可逆转miR-585-5p对胃癌细胞增殖、转移和侵袭的抑制作用。2.miR-585-5p通过直接靶向CREB1抑制MITF转录。miR-585-5p与CREB1的3'UTR结合抑制其mRNA和蛋白的表达。CREB1通过结合MITF启动子区-1357~-1351正性调控MITF的转录表达。3.miR-585-5p通过直接靶向MAPK1抑制MITF的活性。miR-585-5p与MAPK1的3'UTR结合抑制其mRNA和蛋白的表达。MAPK1通过73位点的丝氨酸激活磷酸化增强MITF的活性。.本研究发现了一个新的肿瘤抑制分子miR-585-5p，证实其三个直接靶基因：CREB1、MAPK1与MITF，并与miR-585-5p在胃癌中形成了一个综合调控网络：miR-585-5p表达水平的降低，失去对CREB1、MAPK1和MITF的翻译抑制，使CREB1增强MITF的转录表达；MAPK1激活MITF的磷酸化，增强MITF活性，最终促进胃癌的增殖和转移。