精原干细胞介导基因打靶兔体系的建立

Spermatogonial stem cells (SSCs) is the only stem cells in male animals that can transmit the genetic information to the next generation. Gene target in SSCs to achieve gene target animals is a simple, labor and cost saving technology. However, the technology of gene targeting in SSCs has not become a popular approach due to the difficult establishment of SSC lines, poor efficiency in vivo transfection and low efficiency of gene targeting. In recent years, our laboratory has established a system for the mouse SSCs culture, and gene transfection and targeting with a high efficiency. The applicant plan to combine the three methods for the exploration of feasibility of gene targeting in rabbit SSCs in vivo and in vitro by knockout (MSTN gene knockout) and knockin (the establishment of SCP3-2a-MTS-EGFP reporting system). The establishment of rabbit gene targeting system by SSCs transfection will provide a simple and effective gene targeting method for other mammals that are still immature for micromanipulation. It will provide an effective approach for the industrialization of gene targeting technology.

精原干细胞(SSC)是雄性成体动物体内唯一能够将遗传信息传递给子代的干细胞。对精原干细胞进行基因打靶不需要昂贵的仪器、操作简便，更重要的是可以在短时间内大规模生产打靶动物，实现基因敲除产业化。然而由于长期以来SSC培养技术不成熟、体内转染效果差以及基因打靶效率低等问题，使得精原干细胞打靶技术无法实现。近年来，本实验室建立了成熟的小鼠SSC培养体系，初步探索获得较高体内转染效率，并且利用CRISPR/Cas9技术在兔和猪上获得了极高的基因打靶效率。申请者拟结合这三种技术进行兔基因打靶的探索，在体内、体外对兔SSC进行基因敲除（MSTN基因敲除）和基因敲入（SCP3-EGFP荧光报告系统的建立）。兔精原干细胞基因打靶体系的建立，将为其它由于显微操作技术不成熟的哺乳动物提供一种简单有效的基因打靶方法，促进更多动物模型的建立，为基因打靶产业化提供一个有效途径，为农业和医学的发展提供重要保障。

对精原干细胞（SSC）进行基因打靶操作简便，而且可以在短时间内大规模生产打靶动物，实现基因敲除产业化。我们拟利用CRISPR技术，在体内、体外对SSC进行基因敲除。由于兔的精原干细胞难以长期培养扩大建系，我们主要对小鼠精原干细胞进行体内外基因敲除研究。体外培养条件下，我们通过转染CRISPR基因，获得了敲除MSTN基因敲除的精原干细胞，并建系。进一步我们将敲除质粒直接注射到曲细精管，利用电脉冲使质粒进入内源精原干细胞，通过流式技术，我们分离出了基因敲除的成熟精子，实现体内基因敲除。我们成功建立了精原干细胞的体外和体内基因敲除技术。由于显微操作技术的限制，我们并未获得基因敲除的子代。在实际实验过程中，我们还对实验目标进行了部分调整。我们利用基因打靶技术和兔胚胎显微操作技术建立了兔FAH基因敲除，获得了大量后代，并进行了详细分析；我们利用基因打靶技术和早期胚胎干细胞的培养技术，实现了早期胚胎细胞的分化谱系的调控。项目资助发表SCI论文2篇，培养博士生2名，已获得博士学位。项目投入经费24万元，实际支出24万元，各项支出基本与预算相符。