探索纤毛基因MKS1移码突变致人类颅部神经管畸形发生的作用机制

Neural tube defects (NTDs) are a group of birth defects with highly genotypic and phenotypic heterogeneity. Their pathogenic genes remain unknown. Shh and pcp signaling pathway play an important role in the development of neural tube. It is now clear that primary cilia have a crucial role as a specialized compartment for extracellular signal transduction that responds to sonic Hedgehog (Hh) and pcp signaling pathway. Cilia dysfunction will result in multiple systemic dysfunction, including NTDs as one of the most common phenotypes. Our previous studies have showed that variants in cilia gene are related to human NTDs. Particularly, two frameshift mutations of MKS1 gene creating stop code have been identified in human cranial NTD. We will study the protein binding, expression and localization of core Shh or PCP proteins in MKS1 knock-down MEF cell. we will explore the developmental phenotypes of chick embryo and the localization, expression of core Shh or PCP proteins in neurepithelium in MKS1 knocked-down chick embryo model ...

神经管畸形是一组基因型和表型高度异质性的出生缺陷，致病基因不明。PCP、Shh信号通路在神经管的形成过程中发挥着重要作用。纤毛作为PCP、Shh信号通路中关键元素调节参与了神经管的发育过程。纤毛蛋白功能障碍将导致中枢神经系统等多系统发育异常，NTDs是最常见的表型之一。我们前期研究发现纤毛基因变异和人类NTDs相关，且在人颅NTDs中发现导致MKS1基因表达终止的2个移码突变。本项目研究验证MKS1基因移码突变与人颅部NTDs发生的相关性，利用小鼠胚胎成纤维细胞研究MKS1基因移码突变后Shh、PCP通路核心蛋白的表达水平、分布以及纤毛的形成。利用RNAi 技术建立MKS1基因沉默的鸡胚模型，分析鸡神经发育表型，研究MKS1沉默后Shh、PCP核心蛋白在鸡胚神经上皮细胞表达、定位及纤毛的变化情况。

神经管畸形（NTDs）是由于早期胚胎发育过程中神经管闭合障碍所导致的一类先天性出生缺陷。纤毛作为PCP、Shh信号通路中关键元素参与了神经管的形成过程。纤毛相关基因主要有6个，分别是MKS1、MKS2、MKS3/TMEM67、RPGRIP1L、CEP290和CC2D2A。本项目首先分析了6个MKS基因罕见破坏性变异频率在268个NTDs患儿及两个对照组（185个正常胚胎、300个正常人）中的分布，结果显示MKS基因（MKS1/CEP290/CC2D2A）罕见破坏性变异富集在NTDs组。然后利用二代测序技术及测序数据建立体细胞变异检测方法，分析NTDs携带的罕见破坏性杂合变异，结果表明RPGRIP1L基因破坏性罕见生殖细胞变异、TMEM67及RPGRIP1L基因破坏性罕见体细胞变异在NTDs和正常对照中差异均有统计学意义，从而进一步证实了MKS基因变异对人类 NTDs具有一定致病性。同时，本项目在MDCK和HEK293T两个细胞系中采用免疫共沉淀（COIP）和GST-pulldown检测PCP通路核心分子Vangl2与Par3-aPKC的相互作用，结果表明内、外源性表达的Vangl2蛋白均与哺乳动物上皮细胞中的Par3-aPKC复合物存在相互作用。基于E-cadherin粘附连接在管腔化形成中的重要性，我们针对Par3敲减后的细胞模型，利用免疫荧光、COIP、Transwell、细胞迁移试验，证实Par3、Vangl2参与调节E-cadherin-based粘附连接的形成，从而可能引起异常的管腔化形成，为研究人类NTDs发生机理提供新的思路。