NO3-胁迫下黄瓜CsNMAPK介导的信号转导途径研究

促分裂原活化蛋白激酶MAPK信号途径在各种逆境条件下，通过活化的MAPK激活各种细胞反应，从而提高植物对逆境的抗性。目前关于NO3-胁迫下黄瓜MAPK介导的信号转导途径研究尚未见报道。现通过子房注射法已得到转正义pBI121-CsNMAPK（﹢）和反义pBI121-CsNMAPK（﹣）黄瓜植株。本课题在此基础上，采用营养液培养方法，用不同浓度NO3-处理转基因黄瓜，利用Southern Blot、Northen Blot、Western Blot分别从转录和翻译水平上分析比较转基因和野生型黄瓜叶片和根系CsNMAPK表达，结合内源信号分子NO、内源激素（ETH、ABA等）、茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）含量变化及活性氧系统变化，研究CsNMAPK介导的信号转导系统对NO3-胁迫的响应，探明NO3-胁迫下黄瓜CsNMAPK介导的信号转导途径，为改良根际环境，减轻盐渍化危害奠定理论基础。

（1）通过子房注射法得到转pBI-CsNMAPK（+）黄瓜株系5个和转pBI-CsNMAPK（-）黄瓜株系3个。.（2）系统研究了过量表达CsNMAPK黄瓜幼苗对NO3-胁迫的响应机制，结果表明正常生长条件下，过量表达CsNMAPK黄瓜幼苗长势明显强于野生型。140 mmol•L-1 NO3-胁迫5 d后，过量表达CsNMAPK幼苗叶片和根系中SOD和CAT活性均有所降低，而根中APX活性升高，叶片中O2-.和H2O2含量略有降低；CsNMAPK过表达促进了NO的猝发和ABA的合成；叶片中氮代谢相关酶NR、GS、GOGAT和GDH活性均有不同程度的提高，说明过量表达有利于促进氮代谢平衡。综上所述，CsNMAPK级联信号途径参与了黄瓜幼苗对NO3-胁迫的响应。.（3）系统研究了抑制CsNMAPK表达黄瓜幼苗对NaCl胁迫的响应机制，结果表明抑制CsNMAPK表达黄瓜幼苗长势明显弱于野生型。NaCl胁迫下，转基因黄瓜幼苗CsNMAPK基因的抑制作用比野生型黄瓜更敏感。转基因黄瓜幼苗的地上部和地下部鲜重比野生型降低幅度大；MDA含量显著高于野生型，而SOD活性和Pro积累显著低于野生型。说明NaCl胁迫下CsNMAPK基因与活性氧清除剂的正调控及渗透调节有关。.（4）通过对子房注射法得到的转基因株系T2代种子的PCR检测发现，后代分离严重，不符合1:3分离规律。为此，我们建立了农杆菌介导法获得转基因黄瓜植株的遗传转化体系，并确定子叶节为最佳外植体，转化率约为4.8%；得到转pBI-CsNMAPK（+）黄瓜株系12个，Southern blot分析可知，外源CsNMAPK均以1个拷贝整合到黄瓜基因组中；另外，还得到转pBI-CsNMAPK（-）黄瓜株系5个。.（5）在构建好瞬时表达载体IL-60-BS基础上，通过注射、摩擦和农杆菌浸根三种方式对黄瓜幼苗进行侵染，Real-time PCR检测结果发现，三种方式侵染过的黄瓜幼苗体内，CsNMAPK表达量无变化。经过查阅大量资料，试验所用病毒属烟草脆裂病毒，对茄科植物有很强的侵染性，至今未发现有侵染葫芦科植物的报道，故该瞬时表达载体不适宜在黄瓜上应用。