基于创新实验体系的水稻条纹病毒帽子供体选择机制研究

Segmented negative-sense RNA viruses (sNSV) commonly snatch capped-RNA leaders from host cellular mRNAs. How they select cap donors and the molecular bases of the selection during the process of cap-snatching remain unclear. Previously, we identified the cap donors for RSV using high throughput sequencing strategies. This provided many new explanations as to the cap-donor selection of RSV. However, many of these explanations are speculative, similar to other related studies. In this study, two new experimental systems named “transient cap-snatching” and “geminivirus co-infection” systems, respectively, will be established and coupled to traditional transgenic technologies. With the availability of these systems, we will investigate the the following aspects of cap-donor selection for RSV: i) the role of base-pairing in donor selection of RSV; ii) the influence of the secondary structure of cap donors on the cap-snatching of RSV; iii) the influence of the coding capacity of cap donors on the cap-snatching of RSV; iv) the influence of the cellular p-body pathway and the cap-binding protein eIF4E on the cap-snatching of RSV. By using novel research systems, it is expected that this study will advance our understanding of the cap-snatching of RSV. Therefore, this study has both theoretical and practical significance.

多分体负义RNA病毒（sNSV）普遍从寄主mRNA抓取帽子序列，它们怎样选择以及选择什么样的寄主mRNA作为帽子供体目前还不清楚。水稻条纹病毒（RSV）是一种重要的植物sNSV。本实验室前期以高通量测序手段鉴定了RSV的帽子序列供体，为该病毒帽子供体选择机制提供了一些新的解释。但很多解释缺乏实验证据。本项目拟在近期积累的基础上，建立“瞬时抓帽”和“双生病毒共侵染”两个新研究体系，并与传统的转基因技术相结合，从下面几个角度以实验性手段探究RSV的帽子供体选择机制：（1）“碱基配对原则”对RSV帽子供体选择的影响；（2）帽子供体二级结构对RSV帽子供体选择的影响；（3）帽子供体编码特性对RSV“抓帽”的影响；（4）寄主p-body途径和帽子结合蛋白eIF4E对RSV帽子供体选择的影响。通过创新实验体系，本项目将进一步推进RSV“抓帽机制”研究，具有重要的理论和现实意义。

水稻条纹病毒（Rice stripe tenuivirus, RSV）是我国最重要的粮食作物病毒之一，在分类上属于布尼亚病毒目、白纤病毒科、纤细病毒属的代表种。像其它布尼亚病毒一样，RSV切割寄主mRNA，然后以5‘端切割产物（帽子序列）为引物，转录病毒基因组，生成病毒mRNA，这一过程称为抓帽。我们前期通过大规模获取RSV的帽子序列谱，并将它们Map到寄主mRNA的5’端，提出了一个RSV抓帽的基本模型。由于缺乏合适的实验体系，我们无法对这一模型进行验证，更无法深入解析RSV抓帽过程中与寄主的互作。本项目发现，在RSV侵染的本氏烟通过农杆菌注射的方式瞬时表达一个mRNA，RSV可以从该mRNA抓帽；另外，纯化的RSV病毒粒子在体外能进行抓帽和转录。在此基础上，我们构建了两个实验体系，用于研究RSV的抓帽机制，得到以下结果：（1）RSV从帽子结构下游10到18个碱基处的A或C切割寄主mRNA，但切割主要发生在第11到第15位，并以第13位为最佳位置；（2）RSV对切割位点为A的mRNA表现更大的偏好性；（3）RSV在体外抓帽时也使用引发与重配机制，且同体内一样，转录毒义链时更频繁使用该机制；（4）RSV在抓帽过程中并不偏向那些不能正常翻译的无义mRNA（nsRNA）；（5）敲低寄主NMD途径的UPF1和SMG7后，RSV从nsRNA抓帽的频率显著增加，同时伴随侵染效率的增加，这暗示寄主NMD途径可能通过清除nsRNA而限制RSV的侵染（6）沉默DCP2植株中RSV侵染效率增加，暗示RSV在抓帽过程中与寄主脱帽途径存在竞争；（7）流感病毒抓帽抑制剂DPBA等可以抑制RSV的体外转录，表明RSV在抓帽的一些细节上与流感病毒相似。这些结果为加深了我们对RSV抓帽机制的认识，为进一步解析RSV与寄主的互作奠定了重要基础，同时也为抗RSV药物的开发提供了新线索。