基因修饰的外周血单核细胞移植治疗肝硬化的机制研究

原位肝移植是目前治疗失代偿性肝硬化的唯一有效治疗手段，但由于供肝缺乏、免疫排斥等因素，限制了其临床的广泛应用。干细胞在再生领域取得的巨大进展为失代偿性肝硬化的治疗提供了新的视角。我们的前期工作发现：肝硬化病人的外周血单核细胞（PBMCs）在体外能分化成肝脏样细胞，移植入裸鼠体内能定植于其肝脏并表达人的肝细胞标志物，但具体的机制尚不明确。临床研究同样发现自体PBMCs移植能改善肝硬化患者的肝功能。本项目拟在前期研究基础上，建立肝硬化大鼠动物模型，利用基因转染技术将趋化因子受体CXCR4、促肝细胞生长因子HGF分别转染及共转染入肝硬化大鼠的PBMCs，观察其促移植细胞的定植及分化能力；采用性别交叉实验、PRINS技术检测各实验组大鼠肝内定植的细胞数量；通过免疫组织化学、蛋白免疫印迹、流式分选等技术探讨基因修饰PBMCs参与肝脏损伤修复机制；为临床开展PBMCs移植治疗肝硬化奠定理论依据。

目的：干细胞在再生领域所取得的进展为肝硬化的治疗提供了新视角,但干细胞在受损肝脏的定植有限,限制了其作用的发挥。本项目拟采用基因修饰的方法，将CXCR4导入骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，探讨其促BMSCs定植及其修复肝损伤的机制。.方法：（1）构建慢病毒载体CXCR4/GFP及GFP;(2)培养BMSCs，传至P3, P4代，并对其表型进行鉴定；采用Realtime-PCR法验证BMSCs是否稳定表达CXCR4基因，并保持干细胞特性；（3）采用CCL4法建立肝硬化大鼠的动物模型，分成四组（每组15只），采用性别交叉实验，分别接受DMEM, DMEM-BMSCs， DMEM-CXCR4-GFP/BMSCs，及 DMEM-GFP/BMSCs移植；（4）在移植后的72h， 7天，14天分别处死接受各组大鼠4只，收集血清及肝组织行肝功及组织学检测；（5）免疫组化法检测各组大鼠SRY基因表达；（6）免疫荧光法及激光共聚焦技术检测不同移植时间点大鼠肝组织汇管区及肝实质内细胞CK18，CK19， PCNA, Jagged-1, Noth-1, EPCAM的表达，以及表达GFP/CK19,GFP/CK18, GFP/EPCAM, CK19/Jagged-1等的细胞。.结果：（1）成功构建70只肝硬化大鼠的动物模型；（2）成功构建了CXCR4慢病毒表达载体；（3）CXCR4可促进BMSCs在肝硬化大鼠肝内的定植；（4）接受DMEM-CXCR4-GFP/BMSCs移植组大鼠的白蛋白，甘油三酯水平较其它组有明显改善，但谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及胆红素等指标变化不明显；（5）接受CXCR4/BMSCs移植大鼠肝组织中核增殖抗原PCNA，及肝细胞标志物CK18，胆管上皮细胞标志物CK19等表达较BMSCs移植组及未接受BMSCs移植组高；接受CXCR4/BMSCs移植大鼠的肝脏汇管区表达EPCAM、Notch-1等细胞数较接受BMSCs移植组多。.结论：（1）CXCR4可促进BMSCs在肝硬化大鼠肝内定植；（2）CXCR4修饰的BMSCs可改善肝硬化大鼠的肝功能，其发挥作用的机制可能为定植的BMSCs与肝脏干细胞小生镜（hepatic stem cell niche）相互作用，通过Wnt及其Notch通路调控niche中前体细胞向肝细胞及胆管细胞分化，进而修复肝损伤。