蛋氨酸吸收转运及其参与调控军曹鱼PI3K/Akt/TOR信号通路的机制

Adding methionine can improve the deficiencies of non-fishmeal protein feedstuff in amino acid balance and protein utilization in low fishmeal diet. However, the effects of different form of methionine on fish performance were different. Therefore, it is important for fish to use the amino acids and proteins that absorption sites and transport mechanisms of different forms methionine need to be clear as well as the regulatory mechanisms of methionine on the main pathway PI3K/Akt/TOR of fish growth. Preliminary study of the applicant showed that effects of utilization of different forms methionine on cobia growth and amino acid transporter B0AT1 and ASC cds sequences of the fish. The project intends to cobia as the research object. To assess the activity of methionine on PI3K/Akt/TOR pathway, distribution and timing of change of B0AT1 and ASC at intestinal, and growth performance of cobia, using cell culture, real-time PCR and Western blotting techniques, by methods of cell culture in vitro and perfusion and culture test in vivo.It is to explore the absorption mechanism of methionine as a nutritional signal at intestinal and regulatory mechanism on growth performance of cobia by PI3K/Akt/TOR pathways. To illustrate adding amino acids in the low fishmeal in the necessity and rationality provide theoretical support and reference data.

添加蛋氨酸可以改善低鱼粉饲料中非鱼粉蛋白原料在氨基酸平衡和蛋白质利用率方面的不足，但是鱼类对不同形式蛋氨酸的利用效果存在差异。因此，明确不同形式蛋氨酸吸收位点和转运机制以及其对鱼类生长的主要通路PI3K/Akt/TOR的调控机制对鱼类合理利用氨基酸和蛋白质具有重要意义。申请人前期研究初步得出了军曹鱼对不同形式蛋氨酸的利用效果和军曹鱼氨基酸转运载体B0AT1和ASC cds序列。本项目拟以军曹鱼为研究对象，运用细胞培养、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术，通过体外细胞培养、体内灌注和养殖试验等方法评估蛋氨酸对军曹鱼PI3K/Akt/TOR通路活性、B0AT1和ASC转运载体在肠道的分布和时序性变化以及军曹鱼生长性能的影响，探讨蛋氨酸作为营养信号在肠道的吸收机制以及对军曹鱼生长性能和PI3K/Akt/TOR通路的调控机制。为阐明低鱼粉饲料中添加氨基酸的必要性和合理性提供理论支撑和参考数据。

添加蛋氨酸可以改善低鱼粉饲料中非鱼粉蛋白原料在氨基酸平衡和蛋白质利用率方面的不足，但是鱼类对不同形式蛋氨酸的利用效果存在差异。因此，明确不同形式蛋氨酸吸收位点和转运机制以及其对鱼类生长的主要通路PI3K/Akt/TOR的调控机制对鱼类合理利用氨基酸和蛋白质具有重要意义。项目组根据前期研究结果，运用细胞培养、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术，通过体外细胞培养、体内灌注和养殖试验等方法评估蛋氨酸对军曹鱼PI3K/Akt/TOR通路活性、B0AT1和ASC转运载体在肠道的分布和时序性变化以及军曹鱼生长性能的影响，探讨蛋氨酸作为营养信号在肠道的吸收机制以及对军曹鱼生长性能和PI3K/Akt/TOR通路的调控机制。结果表明氨基酸转运载体B0AT1和ASCT2分别在肠道，肌肉和肾脏有较高的mRNA表达量，B0AT1在中肠表达量最高，ASCT2则在肾脏表达量最高，肠道中以后肠表达量高。从生长性能角度考虑，军曹鱼摄食添加DL-蛋氨酸的低鱼粉饲料可达到和摄食高鱼粉饲料一致的生长性能，参考外源蛋氨酸对军曹鱼肠道氨基酸转运载体mRNA表达的影响可知，摄食1-3h时，低鱼粉饲料中添加的DL-蛋氨酸能够和饲料中的完整蛋白分解的蛋氨酸同步吸收，达到促进生长的效果。体外细胞培养实验结果表明，蛋氨酸能够影响PI3K/Akt/TOR通路活性，影响TOR的表达。体内摄食不同浓度蛋氨酸饲料的实验结果表明，低鱼粉饲料中补充适宜含量蛋氨酸可提高军曹鱼的生长性能和体蛋白质含量，以增重率作为评价指标，经二次回归分析可知，军曹鱼对饲料中蛋氨酸的需要量为1.12%占饲料蛋白质的（2.43%）。在16th周(p<0.05)， 1.24%蛋氨酸（适宜含量组ADE）组鱼体血清IGF-I浓度显著高于0.72%蛋氨酸缺乏组（DEF）和1.86%蛋氨酸过量（EXC）组，ADE和EXC组鱼体血清GH浓度最高。低鱼粉饲料中添加适宜水平的蛋氨酸能上调军曹鱼肠道和背肌ASCT2 、 B0AT1 、IGF-I、TOR mRNA表达。在第16周， 相对于DEF 和EXC组， ADE组鱼体背肌的P-TOR(Ser2446)/ TOR、P-S6K1(Ser371)/ S6K1等蛋白水平均显著上调(P<0.05)。适宜的蛋氨酸浓度可通过刺激PI3K/Akt/TOR信号通路相关基因和蛋白的表达来提高军曹鱼的生长。