PKA对茭白黑粉菌极性生长的调节机制研究

Polarized growth was fundamental to growth, infection of filamentous fungi. Previous studies showed that cAMP pathway and its key kinase PKA regulated polarity of cell growth by modulation of F-actin rearrangement and polar localizing chitin synthases. Unfortunately, most studies focused on pathogenicity and industrial fungi. Regarding the ability of PKA phosphorylate actin and CHSs, conclusive evidence has still been lacking. As the endophyte of Zizania latifolia, which was the second largest planted aquicolous vegetable in China, polarized growth of Ustilago esculenta was essential to gall formation. But fewer related research reports were found in Ustilago esculenta until now. In the present study, we will employ gene knock-out mutants, funtional domain knock-out mutant, point mutation of phosphorylating site, and interaction with plant tissue, to investigate the mechanisms involved in PKA regulating polarity of cell growth in Ustilago esculenta, and the defensive response of the plant tissue of polarized growth of fungi. Our expected findings will uncover the underlying mechanisms involved in PKA regulating polarized growth, and advance our understanding of the interaction between Ustilago esculenta and host plant.

极性生长被认为是关系丝状真菌生长、发育及侵染寄主的关键。研究显示，cAMP途径及其关键酶PKA可通过影响F-actin形成和几丁质合成酶（CHSs）极性定位调控丝状真菌的极性生长。但相关研究多集中于致病微生物和工业微生物，且缺乏PKA对actin、CHSs磷酸化作用的直接证据。作为我国第二大水生蔬菜茭白的内生真菌-茭白黑粉菌，其极性生长对于茭白的形成至关重要，但未见这方面的研究报道。项目组前期研究发现cAMP途径参与茭白黑粉菌极性生长，PKA调节亚基缺失的菌株无法形成菌丝。本研究结合基因敲除、结构域敲除、磷酸化位点突变及植物组织互作等试验方法，及质谱鉴定、FRAP等技术，深入了解PKA调控茭白黑粉菌极性生长的可能机制，及对寄主植物防御反应的影响。所得结果不仅可阐明茭白黑粉菌极性生长的内在机制，且有助于了解茭白黑粉菌与其寄主植物的互作关系。

极性生长被认为是关系丝状真菌生长、发育及侵染寄主的关键。研究显示，cAMP途径及其关键酶PKA可通过影响F-actin形成和几丁质合成酶（CSs）极性定位调控丝状真菌的极性生长，但相关研究多集中于致病微生物和工业微生物。作为我国第二大水生蔬菜茭白的内生真菌-菰黑粉菌，其极性生长对于茭白的形成至关重要。课题组围绕PKA调节菰黑粉菌极性生长的可能机制，开展了以下研究：（1）明确了PKA途径对菰黑粉菌极性生长的必要性，外源cAMP显著影响菰黑粉菌单倍体极性生长、融合及菌丝极性生长，缺失UePKAC的菰黑粉菌单倍体长度显著变长，且无法融合形成菌丝；（2）多肽芯片分析确定了UeActin中2个可能的PKAC磷酸化位点，通过构建磷酸化位点的单一和共同点突变菌株，发现菰黑粉菌PKA途径不直接通过磷酸化Actin影响极性生长；（3）明确了9个CSs共同参与单倍体增殖和融合，且受到cAMP的影响，UeCS2.1、UeCS4.1、UeCS4.2、UeCS5.1和UeCS5.2等CSs基因参与菰黑粉菌单倍体极性生长；干扰F-Actin或Tubulin可以显著抑制CSs的极性运输；除UeCS1.1、UeCS1.2以及UeCS7.1外，其余6个几丁质合成酶可被运往囊泡中积累，且UeCS4.2、UeCS2.1可聚集于细胞顶端，UeCS5.1定位于细胞分裂过程中隔膜的两侧，MMD结构域在UeCS5.1运输过程中起重要作用，PKA途径通过特异性磷酸化调节UeCS5.1在细胞中的定位；（4）通过分离鉴定性亲和单倍体菌株、接种时间、接种方式等优化，成功建立了菰黑粉菌人工接种体系；（5）运用所构建的突变菌株侵染茭白幼苗后发现，CSs缺失未引起植株活性氧的显著变化；在植株体内，除UeCS4.1缺失菌株无法形成融合菌丝外，其余CSs缺失菌株均能形成菌丝，UeCS2.1、UeCS5.1、UeCS5.2、UeCS3.1和UeCS7.1缺失菌株侵染可引起植株防御反应，其中UeCS3.1和UeCS7.1缺失引起的防御反应更为强烈；UeCS2.1缺失显著降低菌丝细胞壁中的几丁质含量。项目共在DNA Research等期刊上发表论文10篇，其中SCI收录论文5篇，一级期刊4篇，授权发明专利1项，申请发明专利2项。本项目不仅阐明了菰黑粉菌PKA途径调节极性生长的内在机制，且相关研究结果和所建人工接种体系为菰黑粉菌与植株互