清心开窍方多靶点抑制类AD大鼠脑内β-淀粉样蛋白形成的机制研究

阿尔茨海默病（AD）是老年人常见病，中医治疗经验丰富。有研究表明，细胞凋亡参与了AD神经元变性，与凋亡基因Bax和Bcl-2关系密切，并伴炎性细胞因子IL-1，IL-6的参与，凋亡信号转导分子Caspase-3在调节神经毒性Aβ生成及AD神经元最终凋亡中有重要作用。本项目通过RT-PCR和免疫组化法观测清心开窍方有效成分对经大鼠双侧杏仁核内注射Aβ25-35片段建立的类AD大鼠模型皮层和海马细胞Caspase-3及相关基因Bcl-2 、Bax 、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响，并通过体外细胞实验，用含中药脑脊液对不同因素所致PC12细胞损伤进行保护，研究中药抗损伤和治疗AD机制。本实验用方源自明代著名医家张景岳《景岳全书》中的"蛮煎"， 由生地、麦冬、芍药、石菖蒲、石斛、牡丹皮、茯神、陈皮、知母等组成，有清心凉血开窍功效，临床运用，疗效显著。关于蛮煎的实验研究未见他人报道。

阿尔茨海默病是一种持续性高级神经功能活动障碍性疾病，常发生于50岁以上的老年人。目前全世界患病人数已超过1800万，我国患病人数约有500万，是世界上患病人数最多的国家。随着世界人口的老龄化，AD已成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。由于AD 的病因、发病机制还不十分清楚，所以尚无特效药物进行治疗或逆转其进展，是世界性难题。关于AD的发病机制现存有多种假说，包括β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ) 瀑布假说、免疫与炎症参与假说、胆碱能缺陷假说、tau蛋白过度磷酸化假说、细胞内钙稳态紊乱假说、过氧化作用假说等。由于AD主要病理特征是老年斑（senile plaque，SP），神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)，神经元大量丢失，而SP的核心成分为β-淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ），所以，目前普遍认为聚集状的Aβ具有神经毒性，而Aβ在脑内神经细胞中的沉积是AD发生的起始事件，是诱发AD发病通路，也是AD形成和发生的关键因素。因此，Aβ也是本研究项目的切入点。结合目前国内外西药治疗AD中的一些不足，本实验采用源自明代著名医学家张景岳《景岳全书》中的“蛮煎”改良，具有清心凉血开窍功效的“清心开窍方”。通过体外细胞实验及大鼠整体实验，研究清心开窍方多靶点抑制类AD大鼠脑内β-淀粉样蛋白形成的机制。.　　　在整体实验中，本项目针对目前国内外研究AD的最热点学说——Aβ假说进行研究，分别以双侧杏仁核和海马区注射Aβ制造类AD大鼠模型，以清心开窍方水煎剂、清心开窍方总皂甙、多糖及挥发性成分灌服，用RT-PCR方法和免疫组化方法检测皮层及海马区细胞凋亡、炎性反应相关基因及蛋白表达，研究清心开窍方治疗AD的机制。在体外细胞实验中，首先采用含清心开窍方脑脊液，对谷氨酸、过氧化氢（H2O2）、连二亚硫酸钠（Na2S2O4）、KCL、β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）所致PC12细胞损伤的保护作用进行观察，以了解该方通过血脑屏障后的作用性。其次，研究清心开窍方对Aβ肽所致 17d胎龄大鼠皮层神经细胞凋亡的保护作用、清心开窍方中Aβ结合成分对原代神经元的保护作用机制研究及清心开窍方对Aβ肽1-42聚集和纤维形成的影响。结果表明，清心开窍方能明显改善AD大鼠的学习记忆能力，其机制可能是通过多途径抑制AD大鼠脑内Aβ形成完成的。