苜蓿根瘤菌向种子内运移和定殖的动力学过程及其内生机理

The Rhizobia formation in alfalfa seeds involves the migration and colonization of the vegetative and reproductive stages, the vegetative stage of Rhizobium in leguminous plants in the migration and colonization dynamics and the key mechanism has been studied (Fund Project .31060326), which laid the foundation of the migration and colonization of Rhizobia to seed and which the nodulation phenomenon between generations with seeds as carrier and nitrogen fixation. Fluorescence marked endogenous and exogenous Rhizobia will be used to inoculate Gannong No.5 alfalfa, boron、gibberellin and matrine as the interference factor to make clear the migrational pathway and colonization position and the dynamic processes of both endogenous and exogenous Rhizobia in reproductive stage alfalfa plants to seed, as well as the migration and colonization mechanism differences and the mechnism of the interferences in reproductive stages, especially in seed, and simultaneously, to guide the excellent target Rhizobia into seeds with the marked rhizobia,to obtain alfalfa seeds carried with excellent target Rhizobia—seeds+endogenous Rhizobia, and to explore the nodulation and generation phenomenon of rhizobium in seed. The ultimate goal is to realise the efficiency stability and sustainability of the endogenous marked Rhizobia and lay the foundation of developing new avenues of leguminous plants and rhizobia utilization.

苜蓿种子内生根瘤菌的形成涉及营养生长期和生殖生长期的运移与定殖两个阶段，基金项目（31060326）已对营养生长期根瘤菌在植株体内的运移与定殖动力学及关键机理问题进行了研究，为生殖生长期根瘤菌向种子器官的运移与定殖以及根瘤菌以种子为载体进行传代结瘤固氮研究奠定了基础。本项目采用绿色荧光蛋白标记的内源及外源根瘤菌接种紫花苜蓿，以硼、赤霉素、苦参碱为干扰因素，研究苜蓿生殖生长期两类根瘤菌在三种外源物质干扰下向种子器官运移的路径及定殖部位的差异性及其动力学过程，探明生殖生长期苜蓿植株体内根瘤菌向繁殖器官，尤其向种子器官运移和定殖的扰动机理，以及利用标记根瘤菌的运移通道向种子导入优良目标根瘤菌，实现高效固氮根瘤菌与苜蓿良种的精准高效组合体——种子+内生根瘤菌组合体，并探索种子内生根瘤菌的传代结瘤能力，实现种子内生目标根瘤菌的效能稳定性与可持续性。为开辟豆科植物根瘤菌利用的新途径奠定基础。

为探明生殖生长期苜蓿植株体内根瘤菌向繁殖器官，尤其向种子器官运移和定殖的扰动机理，并探索种子内生根瘤菌的传代结瘤能力。项目采用绿色荧光标记法构建外源和内源标记根瘤菌S.12531f和R. GN5f，筛选出硼、赤霉素和苦参碱三种外源扰动物质的适宜接种浓度，在接种方法、接种部位和外源防御反应信号干扰物对内源根瘤菌和外源根瘤菌在植株体内运移能力和定殖规律的影响方面进行了试验和探讨。同时探索如何使种子内的目标根瘤菌定殖并稳定传代和结瘤。经过历时4年的研究，项目达到了预期目标，并得到以下重要发现和结论：.（1）根部接种苜蓿幼苗，以未添加外源扰动物质的接种方法为对照筛选出利于R. GN5f在苜蓿体内运移和定殖的外源物质浓度分别为：100 mg L-1硼、1 mg L-1赤霉素和100 mg L-1苦参碱；利于12531f在苜蓿体内运移和定殖的外源物质浓度分别为1 mg L-1硼、10 mg L-1赤霉素、300 mg L-1苦参碱。.（2）采用不同接种方法、不同生育时期、不同外源扰动物质接种田间苜蓿时的适宜接种时期为结荚期，适宜接种方法为添加硼的荚果皮喷射接种。由荚果皮接种的两种荧光标记根瘤菌可向内部的种子运移并大量定殖，根瘤菌具有可通过表皮向细胞内扩散的能力。.（3）接种不同来源的目标根瘤菌适宜的保存方法不同。含相同目标根瘤菌的种子以25℃干燥和-4℃贮藏时种子内根瘤菌数量高于25℃和4℃。.（4）含目标根瘤菌的种子可将目标根瘤菌菌传代至T1代幼苗中，在根茎叶内均可检测出。且幼苗根瘤的固氮能力、根瘤菌数量和重量明显高于未接菌的对照处理。接种苜蓿根瘤菌的次代种子促进了苜蓿植株内的优良菌株数量和根瘤菌的形成，能显著提高固氮能力和固氮潜力。.以上科学发现和结论对探明目标根瘤菌引入种子器官的动力学因素，提高种子内优质目标根瘤菌稳定增殖并传代奠定了坚实的理论基础。研究成果为生产携带优良外源根瘤菌的优质苜蓿种子提供了理论基础和技术先导。研究过程中，发表多篇高质量的学术论文，具有较高的科学价值和良好的应用前景。