NFκB-Orai1对能量负平衡介导的犊牛肝细胞脂质沉积调控机制的研究

Fatty liver disease of dairy cows during the transition period, which caused by the negative energy balance, are closely associated with high blood concentration of nonesterified fatty acid (NEFA). NEFA can active the oxidative stress and endoplasmic reticulum (ER) stress and NF-κB signaling pathway to induce hepatic lipidosis. Moreover, high concentration of intracellular Ca2+ can also induce hepatic lipidosis in human NAFLD. NFκB is known to upregulate Orai1, the Ca2+ channel accomplishing store operated Ca2+ entry (SOCE). We hypothesize that high blood concentration of NEFA would activate NFκB-sensitive Orai1 expression signaling pathway to increase ER stress, thus induce hepatic lipidosis in dairy cows. In this program, the calf hepatocytes in vitro are cultured and treated with NEFA, while the hepatocytes are silencing p65,Orai1 and treated NFκB or Orai1 inhibitors, respectively. SOCE, p65, Orai1, H2O2/NADPH enzyme, GRP78, SREBP-1c, ACC1, FAS expressions levels and activities are measured. The effects of NEFA on the NFκB- sensitive Orai1 expression signaling pathway are evaluated to clarify the regulation role of NFκB-Orai1 expression on hepatic lipid metabolism in dairy cows. This study will further provide valuable information to reveal the pathogenesis of fatty liver in dairy cows.

围产期能量负平衡导致的高NEFA血症是诱发奶牛脂肪肝的重要因素。NEFA导致肝细胞内的氧化应激、内质网应激以及NFκB的激活在介导肝脂沉积中均发挥重要作用，且有研究表明细胞内的高钙也可引起肝脂沉积，而申请者前期研究发现NFκB能通过激活Orai1调控细胞内钙池引发的Ca2+的进入。据此，本项目提出高NEFA可能通过激活NFκB-Orai1通路促进钙离子内流导致内质网应激，从而导致脂肪酸的从头合成增加，进而引起脂质沉积的科学假设。本项目拟通过体外培养犊牛肝细胞，经高NEFA处理模拟能量负平衡状态，采用基因沉默技术以及NFκB/Orai1抑制剂处理方法，监测细胞内钙离子的释放与进入过程，评价肝细胞氧化应激状态，内质网应激水平及脂肪酸从头合成因子的调控作用，从而明确NFκB-Orai1通路及细胞内钙对高NEFA介导奶牛肝细胞脂沉积的调控机制，为阐明奶牛脂肪肝的发病机制提供理论依据。

本项目旨在阐明NFκB-Orai1通路及细胞内钙离子对高NEFA介导奶牛肝细胞脂质沉积的调控机制。项目采用两步灌流法分离犊牛原代肝细胞，通过添加1.2 mM NEFA培养12 h成功构建肝细胞脂质沉积模型。利用NFκB的抑制剂wogonin、Orai1的抑制剂2APB和BTP2、SiOrai刺激细胞，利用电生理、QRT-PCR、Western Blot、激光共聚焦等技术，阐明高NEFA通过激活NFκB-Orai1通路促进钙离子内流导致内质网应激，从而导致脂肪酸的从头合成增加，进而引起脂质沉积。结果显示，随着NEFAs刺激时间的延长，胞内Ca2+浓度在不断升高，刺激12 h后，NF-κB p65、Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的转录水平和蛋白水平显著增加，脂滴富集水平增强；NF-κB抑制剂wogonin、Orai1抑制剂2APB和siOrai1刺激后，NF-κB p65、Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的转录水平和蛋白水平显著降低，脂滴减少。在0.5 h时可显著增加Orai1的表达量并且1 h时显著增加Ca2+浓度，氧化应激相关指标GSH和SOD在1 h极显著降低， MDA和H2O2在1 h极显著升高。内质网应激相关分子PERK、IRE1、GRP78、ATF6、CHOP在6 h显著增加。随后在肝细胞中添加氧化应激抑制剂NAC阻断由NEFA引起的Orai1以及主要的ER应激蛋白的表达。NEFA可上调线粒体损伤相关分子VDAC1，CLPP，CypD丰度，诱导线粒体通透性过渡孔的瞬时开放，增加线粒体膜电位。此外，NEFA诱导氧化应激相关指标GSH和SOD的降低，MDA、H2O2和ROS的升高，增加内质网应激相关分子PERK、IRE1、GRP78、ATF6和CHOP的表达。Orai1的沉默或抑制可消除氧化应激，包括增加的GSH和SOD含量，减少MDA和H2O2含量以及减少的ROS产生。ER应激蛋白的丰度被下调，线粒体功能得以恢复。此外，Thapsigargin或Ionomycin诱导的线粒体功能障碍并导致Orai1表达增加。综上所述，NF-κB激活奶牛体内Orai1使细胞内Ca2+内流，激活氧化应激以及线粒体损伤进而导致内质网应激，上调肝脏脂肪从头合成因子，诱发围产期奶牛脂肪肝疾病，开启围产期奶牛脂肪肝病药物治疗研发的新道路。