突触结合蛋白Synaptotagmin-1对胞吞的调节机制

Our recent study found that Synaptotagmin 11 inhibits clathrin-mediated and bulk endocytosi to ensure the precision of exocytosis-coupled endocytosis (Wang et al., J Neurosci, revised; Wang et al., Nat Commun, revised; Liu et al., J Neurosci, 2011; Liu et al., J Physiol, 2011). In contrast, Syt1, another Syt protein functioning as the primary Ca2+ sensor for exocytosis, is reported to positively regulate clathrin-mediated endocytosis for the coupling of endocytosis to exocytosis. We surprisingly found that silencing the expression of Syt1 in dorsal root ganglion neurons inhibited exocytosis during sustained neurotransmission, while exo-endocytosis was greatly accelerated. This study aims to investigate function of Syt1 in endocytosis and vesicle recycling using real time membrane capacitance (Cm) recording, Ca2+ imaging, electrom microscop, TIRF imaging, FM upatke, transferrin uptake, and molecular biochemical tools. This will shed light on mechniams underlying the precise regulation of endocytosis and its coupling to exocytosis during neurotransmission.

申请人对囊泡分泌调控分子机制的研究（Wang et al, J Neurosci, revised; Nat Commun, revised; Liu et al, J Neurosci, 2011; J Physiol, 2011）发现，突触结合蛋白Syt11抑制神经元的胞吞过程，确保胞吞与胞吐的耦联和平衡。本申请将研究该家族最重要的成员Syt1对胞体分泌和内吞的双重调控机理。Syt1是神经递质释放重要的钙离子感受器，还可促进网格蛋白介导的内吞作用，被认为是突触分泌中胞吐-胞吞耦联的重要调节蛋白。我们发现沉默Syt1的表达抑制了强刺激条件下的胞吐作用，但同时加速了相应的胞吞过程。我们拟沉默Syt1的表达，采用膜电容记录、钙成像、TIRF成像、电镜及Co-IP等研究其对胞吞与囊泡回收速率的影响，探讨Syt1对胞吞调节的分子基础，为理解复杂而精细的胞吞过程及其与胞吐耦联的分子机制提供线索。

囊泡分泌是神经元最基本的生命活动之一，包括胞吐、胞吞及囊泡再循环等过程。胞吐与胞吞过程在时间和空间上紧密偶联，在维持细胞膜动态平衡、囊泡膜蛋白的回收与再利用、神经递质可持续释放等方面均发挥重要作用。有关胞吐-胞吞偶联与平衡的调节机制已有大量研究，发现SNARE、synaptophysin及突触结合蛋白synaptotagmin-1（Syt1）等正向调节蛋白，以确保胞吞快速而有效的进行，然而这一重要细胞转运关键过程的负向调节机制却是一片空白。本项目围绕胞吞作用的负向调控机制展开了深入而细致的研究，并取得一系列研究成果：.1.首次实现在分泌水平不变的情况下研究Ca2+对胞吞的调节作用，提供直接证据证明Ca2+可不依赖于胞吐作用而直接调控胞吞过程。.2. Syt1作为钙离子感受蛋白在胞吐-胞吞活动中同时发挥着重要的正向与负向调控作用，在低兴奋强度下促进胞吞过程，在强刺激条件下则抑制胞吞过程。这是首次发现Syt1对胞吞的抑制作用，也是首次揭示钙离子抑制胞吞作用的分子机制。.3. Syt1作为胞吞作用的Ca2+感受蛋白，促进网格蛋白介导的胞吞过程，而抑制快速相的巨胞吞过程，既保证胞吞快速而有效进行，又避免发生过度胞吞现象。.4.钙不依赖性Syt成员Syt11为胞吞作用重要的负向调控蛋白，通过抑制细胞膜内陷结构的形成同时抑制网格蛋白介导的胞吞作用和巨胞吞过程，进而抑制囊泡循环与再利用及神经递质的可持续释放（EMBO Rep，2016，封面文章）.5.提供在直接的体证据证明Syt11是parkin的底物，parkin失活导致Syt11在DA神经元中异常积聚，进而抑制DA神经元的胞吞与囊泡循环过程，抑制DA分泌，引发PD的病理过程，揭示了困惑已久的parkin导致PD的病理机制（Nat Commun，in press）。.6.发现钙非依赖性分泌的分子机制（Neuron, 2017, Nat Rev Neurosci亮点评述；F1000Prime特别推荐）；发现局部钙信号对量子化与亚量子化分泌的调节作用与机制（Sci Signal，2017，封面文章，Science亮点评述）；发现TRPA1介导的溶酶体钙释放及其在神经分泌与痛觉调节中的重要作用（J Cell Biol, 2016,同刊发表评述文章高度评价）。