肝素酶在肝癌瘤栓形成、微血管捕获中的关键作用及其机制

Primary hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors in our country. Intrahepatic hematogenous spread is the main metastasis way of HCC, and tumor emboli formation and capture within capillary are the key step. Based on the essential clue found in our protophase study, we presume that heparanase (HPSE) and its substrate, heparan sulfate proteoglycan (HSPG), could participate tumor emboli formation and capture within capillary..In this study, the more precise proof of HPSE/HSPG will be explored by using cell adhesion, transwell chamber, immunofluorescence and animal experiments. The molecular mechanism will be also probed by detecting the effect of HPSE/HSPG on platelet activation, adhesion, cellular localizations of HSPG and adhesion molecule and basal membrane of endothelial cells, and exploring the way of transedothelial migration of hepatoma carcinoma cells. .The study will offer a new view angle for the study on the mechanism of intrahepatic dissemination of HCC. It will not only enrich the research achievement but also provide new target and valid time window for developing effective prevention and cure measure.

原发性肝癌(简称肝癌)是我国常见恶性肿瘤，以肝内血行转移为主,门静脉瘤栓形成、微血管捕获是其中的关键步骤。根据我们前期研究发现的基本线索，推测肝素酶(HPSE)和其底物硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)可能在上述过程中发挥重要作用。.本项目拟采用细胞粘附、Transwell小室、免疫荧光、动物瘤栓和转移灶形成试验等方法, 分别在分子、细胞和组织等不同层次，探寻HPSE/HSPG介导肝癌瘤栓形成、微血管捕获的确切证据；探讨HPSE/HSPG对粘附分子及其受体表达、血小板脱颗粒释放物、HSPG和粘附分子细胞定位及血管内皮细胞基底膜完整性的影响，探明肝癌细胞跨内皮迁移方式,以阐明HPSE/HSPG介导瘤栓形成、微血管捕获的机制。.本项目为肝癌门静脉播散转移的机制研究提供了新视角，不但丰富和完善其研究成果，而且为研发有效防治措施提供新的靶点和有效时间窗。

原发性肝细胞癌(简称肝癌)是我国常见恶性肿瘤。手术切除率和5年生存率均低,主要原因在于以肝内血行转移为主的高转移复发率。肝素酶(HPSE) 是肿瘤侵袭转移的关键分子之一，此前研究提示HPSE可能在肝癌瘤栓形成、微血管捕获中发挥重要作用。2012年，我们申请获批国自然项目“肝素酶在肝癌瘤栓形成、微血管捕获中的关键作用及其机制（81272412 ）”。4年来，根据项目计划书要求，进行如下研究，并获得较多重要结果和关键数据：.1.首先，国内外首次成功建立了裸鼠肝癌门静脉瘤栓模型。为探寻HPSE介导肝癌微瘤栓形成的证据，项目组利用高表达HPSE的肝癌细胞腹腔注射，国内外首次成功建立了肝癌门静脉瘤栓模型（5/5），为后续实验奠定基础；.2.第二，在动物实验层面，成功证明HPSE参与介导肝癌微瘤栓的形成。本项目在上述动物实验中应用HPSE抑制剂肝素可明显瘤栓肝癌成瘤率、血管受侵率和门静脉瘤栓形成率；肝癌细胞与血小板粘附试验，因血小板难以采集、存储，实验条件特别是动态粘附试验难以掌握，而未得出预期结果；.3.继之，初步探讨了HPSE介导肝癌门静脉微瘤栓形成的分子机制。在肝癌门静脉瘤栓模型组织切片中，P-选择素（P- Sel）表达显著升高，免疫荧光实验证实其主要表达于血小板（α颗粒）。提示其可能是HPSE介导微瘤栓形成的重要因素。.4.第四，成功证明HPSE参与介导肝癌微血管捕获和跨（血管）内皮迁移。项目组通过肝癌细胞与血管内皮细胞的粘附试验及跨内皮迁移试验，证明高表达HPSE肝癌细胞易于被微血管捕获及跨内皮迁移，转染HPSE RNAi后，其被微血管捕获及跨内皮迁移能力明显下降；.5.最后，初步探寻了HPSE介导微血管捕获及跨内皮（细胞）迁移的分子机制。在上述粘附试验中，通过检测内皮细胞多种HPSE底物多配体蛋白聚糖(Syn)、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和选择素（Sel）的表达，发现HPSE RNAi干扰组中Syn-3表达明显高于对照组，而ICAM-1和E-Sel低于对照组，上清液中ICAM-1含量亦显著升高；Syn-3主要位于细胞浆，ICAM-1、E-Sel主要位于细胞膜；HPSE其他下游分子Syn-1和P–Sel则无明显变化。提示Syn-3、ICAM-1、E-Sel等可能参与HPSE介导的肝癌细胞与血管内皮细胞粘附及跨内皮迁移过程。