三角帆蚌珍珠形成相关基因拷贝数多态性及其与育珠性状的关联分析

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我国特有种，在淡水蚌中育珠质量最佳。基因拷贝数多态（CNV）是一种新型分子标记。本项目在开发三角帆蚌外套膜 cDNA文库中一批与珍珠形成相关基因EST序列基础上，选取钙调蛋白、EF手形钙结合蛋白、T型钙通道CACNA1H、铁蛋白和Sox5等5个蛋白基因，测定他们的全长cDNA和基因组DNA序列；比对分析目的基因序列和已知具CNV多态性的基因，确定基因拷贝数变异区，在该区域设计目的基因检测引物，筛选单拷贝基因作为内参，结合实时定量PCR相对定量方法，建立三角帆蚌基因CNV检测方法；选取遗传多样性高的鄱阳湖选育群体三角帆蚌，分析该5个基因的CNV多态性，并检测这些蚌的产珠量、珍珠平均粒径、圆珠率三个育珠性状，然后进行多态性CNV位点与三角帆蚌育珠性状间的关联分析，寻找与育珠性状相关的功能性CNV标记。为进一步开展分子标记辅助育种奠定基础。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)在我国广泛分布，是主要的淡水珍珠贝类。基因拷贝数多态（CNV）是一种新型分子标记, 本项目以三角帆蚌基因3’UTR区锚定引物作为单克隆位点的内参引物，在基因保守区域设计引物作为检测引物，结合实时定量PCR，利用相对定量方法，建立基因拷贝数检测方法。本项目共发现珍珠形成相关基因62个。其中采用前期1代测序技术发现了29个与珍珠形成相关的基因，包括5个钙代谢相关基因、12个细胞外基质蛋白基因和12个细胞骨架蛋白基因。采用2代测序技术发现6个几丁质代谢相关基因，5个中等酸性贝壳蛋白基因，2个碱性贝壳蛋白基因，10个钙代谢相关基因，6个其他金属离子代谢相关基因，2个基质蛋白基因和2个基质蛋白结合蛋白基因。比较数字表达谱分析共鉴定出358个差异表达基因。其中137个基因在分泌紫色珍珠质组织中高表达，221个基因在分泌白色珍珠质的组织中高表达。采用RACE技术获得铁蛋白、钙网蛋白、37kDa LRP、金属结合蛋白、ApoB、Perlucin和HcMSP130-rel-2共7个基因全长cDNA序列，发现鄱阳湖野生群体和金华养殖群体三角帆蚌存在铁蛋白基因拷贝数多态性，并发现三角帆蚌铁蛋白基因拷贝数多态性与壳长生长显著相关，可以作为选择育种的分子标记。ApoB基因在紫色壳三角帆蚌外套膜和闭壳肌的表达量明显高于白色壳三角帆蚌外套膜和闭壳肌的表达量，说明ApoB基因表达影响三角帆蚌的贝壳珍珠层及珍珠的颜色。金属结合蛋白基因在鳃组织中的表达最高，在外套膜中表达次之，说明该基因有可能参与三角帆蚌体内金属的代谢过程，进而影响珍珠颜色。HcMSP130-rel-2、钙网蛋白、Perlucin和37 kDa LRP共4种基质蛋白基因在外套膜中均有较高表达量，其中HcMSP130-rel-2、钙网蛋白在外套膜组织中表达量最高，4个在贝壳修复过程中高表达现象及其原位杂交结果说明4个基因与珍珠质分泌功能相关。本研究开发的珍珠形成相关基因为解析珍珠形成机制提供分子依据，并首次研究珍珠形成相关基因拷贝数多态性及其与性状的关联，揭开拷贝数多态性应用于珍珠贝类分子标记辅助育种的新篇章。上述研究成果共发表标准论文7篇，其中SCI论文4篇，中文核心期刊论文3篇，2篇论文发表在PLOS杂志，授权发明专利5项，实用新型专利2篇，申请发明专利6项。本项目按计划内容完成。