V-ATPase在AMDE1诱导的非经典自噬中的作用及机制研究

Autophagy is a highly evolutionarily conserved pathway to degrade intracellular proteins and damaged organelles. Autophagy plays important physiological roles in maintaining cell homeostasis and regulating various diseases. Recently, studies showed that chemicals could bypass some core autophagic genes to induce autophagy, but the regulatory mechanisms are still unclear. In our recent work, one novel chemical AMDE1 was found to induce ULK1- and Beclin1-independent non-canonical autophagy. The ubiquitin level is tightly realated to the function of AMDE1-induced autophagy. We also found that specific inhibition of V-ATPase could generally suppress non-canonical autophagy. So a novel hypothesis was put forward that V-ATPase could mediate the induction of non-canonical autophagy. Based on our previous works, we try to determine the signal pathways of AMDE1 treatment in detail, clarify the effect of V-ATPase positive structure on the formation of autophagosome, understand the interaction among V-ATPase, ubiquitin, and Atg16, and their roles in the process of non-canonical autophagy. The implementation of this work will be helpful to elucidate the regulatory mechanism of non-canonical autophagy in the cellular and molecular level, broaden the understanding of different working pattern of autophagy, and provide the new ideas for regulating autophay-related pathophysiological processes.

自噬是一种高度保守的降解胞内蛋白及受损细胞器的主要途径，对维持细胞稳态、调控多种疾病具有重要作用。近年发现一些化合物可以在某些自噬基因缺失的情况下诱导非经典自噬，但具体调节机制并不明确。我们近期研究发现，新化合物AMDE1可以不依赖ULK1和Beclin1诱导非经典自噬的发生，泛素化水平和定位与自噬作用密切相关。特异性地抑制V-ATPase或沉默其亚基可以阻断非经典自噬的发生，且该作用具有普遍性。由此提出V-ATPase介导非经典自噬这一新观点。本项目拟在前期基础上，确定化合物AMDE1诱导非经典自噬发生的具体通路；阐明V-ATPase所在细胞器对自噬体形成的影响；明确V-ATPase、泛素蛋白和Atg16之间的作用关系及在自噬调控中的作用。本项目的开展有助于在细胞和分子水平揭示非经典自噬的发生平台和调节机制，拓宽对不同种类自噬作用方式的理解，为自噬相关疾病的干预提供新的见解。

自噬是真核细胞中的一种溶酶体代谢过程，对维持细胞稳态至关重要，自噬功能紊乱与癌症、糖尿病和神经退行性疾病等疾病密切相关。自噬体是自噬发生的标志之一，它的形成依赖一系列ATG蛋白。但近年来，越来越多的研究表明自噬体的形成可以不依赖部分ATG蛋白，且也有研究发现可以依赖部分ATG蛋白形成类似于自噬体的结构，我们把这些形式的自噬统称为非经典自噬。非经典自噬在多种生理和病理进程中都有发现，且已发现多种化合物可以诱导非经典自噬，但其发生机制尚不明确。.AMDE1是我们实验室前期发现的一种具有双重作用的自噬调节剂，实验过程中意外发现它能诱导非经典自噬。本文主要以自噬标志物LC3-Ⅱ为指标，通过基因沉默和抑制剂等方式，探讨AMDE1诱导的非经典自噬的特征及发生机制。我们发现，AMDE1诱导的非经典自噬不依赖ULK1，FIP200，VPS34和ATG9，但依赖ATG5和Atg8/LC3，且高尔基体很有可能是其重要的膜来源。此外，Baf能够抑制AMDE1诱导的非经典自噬，而CQ、NH4Cl不能。根据以上特征，我们从高尔基体和Baf等方面入手，结合文献及分子捕捉技术对AMDE1诱导的非经典自噬的形成机制进行了探索。结果表明，敲低Rab9、GBF1、ATP6V1A和ATP6V1D等基因对AMDE1诱导的非经典自噬均无明显影响；PKA、PKC、Sirt1和p300的激动剂和抑制剂均不能抑制AMDE1诱导的非经典自噬；敲低Vimentin能够有效抑制AMDE1诱导的非经典自噬；AMDE1能够诱导产生一种不同于STS诱导产生的剪切型Caspase3。综上所述，本文明确了AMDE1诱导的非经典自噬不通过ULK1复合物和Beclin1复合物介导的的经典诱导成核途径，从ATG16L1或其上游直接启动自噬，此过程中高尔基体可以为自噬体提供膜组分。此外，我们筛选出了Vimentin，发现它能够有效抑制AMDE1诱导的非经典自噬，为更深入的机制研究奠定了基础。.通过本项目资助，已发表10篇相关文章，包括2篇Autophagy，1篇Cells等重要期刊。授权专利一项。