FLC基因选择性剪切在柑橘类植物阶段发育中的作用及其分子机理

木本果树自播种到首次开花需经历漫长的童期，极大地制约了果树遗传学研究和育种实践。前人研究表明，植物成花调控的关键基因相对保守，无论是草本还是木本来源的成花促进基因过量表达都能使转基因植株童期缩短，表明自然状态下木本植物渡过童期之前成花受到抑制。FLC是春季开花植物感受低温、抑制成花的关键基因。我们在前期研究发现枳早花变异与野生型相比、开花植株与童期植株相比，FLC表达水平较低，且不同发育阶段存在选择性剪切，这一现象在草本植物中少见，可能与木本植物阶段发育的多年性有关。本项目拟以荧光定量和原位杂交分析FLC选择性剪切发生的时序及组织特异性，以染色质免疫共沉淀分离靶基因，转基因敲除及超量表达研究FLC不同转录本的功能，以揭示FLC在木本植物阶段发育调控中的作用，顺着上下游基因的相互作用，找到更多发育相关的基因并揭示基因与环境、基因与基因网络调控的机理，为最终实现木本植物童期和花期调控奠定基础。

前期研究我们发现了柑橘不同发育阶段，FLC基因存在不同的选择性剪切，本项目研究FLC基因作用及机理。通过染色体步移克隆了柑橘类植物FLC基因DNA全长，发现它们都具有超长的第一内含子，抗寒性强的枳属植物较其他柑橘植物多一个573bp的长插入序列。较长内含子的构象变化可能与其低温响应有关。亚细胞定位表明，FLC主要在细胞核表达。不同转录本与Gal4融合酵母表达进行离体转录活性检测，发现成年期出现的两个转录本具较高的转录活性，可能是正常行使FLC功能的稳定转录本形态。对FLC在高、低温处理及不同光周期、GA3 诱导条件下表达模式及与主要成花基因关系分析，发现PtFLC和PtSVP同样为开花抑制因子，但表达模式有不同。PtFLC在长日照、GA3和低温处理条件下，表达量变化较大，并且与PtFT、PtLFY和PtAP1表达量呈现联动的负调控关系。将不同转录本分别转化拟南芥，发现只有成年期转录本具较强的成花调控作用，而童期转录本对成花的影响较小。表明不同发育时期的FLC转录本功能是有区别的。完成了在早实枳中超表达、普通枳中干涉表达的遗传转化，成功获得了转化植株，对下游相关基因的表达水平变化进行了初步分析，证明FLC基因参与了成花相关基因转录水平的调控作用。利用酵母双、单杂交技术，研究了FLC与上下游基因之间的关系。获得了与FLC互作的蛋白。分离克隆了FLC的启动子序列，构建了PtFLC::GUS融合表达载体，转化拟南芥，观察发现PtFLC启动子在分生组织、维管组织中表达量较高。酵母单杂交筛选获得FLC启动子结合蛋白，而FLC蛋白与SOC1启动子有较强的结合。从早实枳克隆了与FLC互作的PtELF5基因。实时定量和原位杂交分析表明，PtFLC和PtELF5之间在表达时期、消长动态和表达部位变化等诸方面均呈现密切相关，推测由于ELF5对FLC表达的抑制作用，引起早实枳FLC在成花转变阶段、顶端分生组织中下调表达，释放其成花限制阀门，启动成花。.综上所述，FLC基因在早实枳成花调控过程中起重要作用，选择性剪切、内含子结构及启动子元件，分工、协同调控FLC对发育时期和低温响应，特异性调控早实枳的阶段转变。