菌寄生过程中寄主真菌识别相关蛋白的基因克隆与功能研究

菌寄生真菌与寄主真菌的相互识别是菌寄生过程中一系列事件中的初如事件，在菌寄生中起关键作用, 研究菌寄生中寄主真菌与菌寄生真菌相互识别的分子机制具有重要科学意义。尽管人们建议寄主真菌与菌寄生真菌相互识别的分子机制可能属于凝集素-糖（agglutinin-carbohydrate）相互作用模式，但目前在分子水平上没有直接的证据来支持和证明这个假说，寄主真菌识别相关蛋白-凝集素的基因克隆和功能研究没有报道。本申请课题选择寄主真菌串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）与菌寄生真菌纤细齿梗孢（Olpitrichum tenelum）作为研究体系，通过对这种菌寄生方式中寄主真菌识别相关蛋白-凝集素基因的克隆和表达，利用基因过量表达、基因缺失和基因功能互补技术进行基因功能研究，预期明确寄主真菌识别相关蛋白-凝集素基因的序列、结构和功能，为深入研究菌寄生过程中信号传递的分子机制奠定基础。

疏水蛋白是由丝状真菌特异产生的一类分泌型小分子蛋白质，肽链含有8个半胱氨酸，形成四个链内二硫键。疏水蛋白在真菌菌丝的生长发育，孢子的扩散传播以及病原真菌致病性上都有重要的功能。本研究选取轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）的五种疏水蛋白基因作为研究对象，研究它们表达产物的凝集活性以及与轮枝镰孢的寄生性真菌纤细齿梗孢（Olpitrichum tenellum）互作中的功能。本文首先采用不同的方法提取轮枝镰孢菌孢子表面蛋白，SDS-PAGE电泳检测结果表明，采用三氟乙酸法获得了约7条蛋白质条带，其中一条12kDa处蛋白含量较高；采用SDS煮沸法获得了约4条蛋白质条带且有约2条带分子量在12kDa处；蔗糖渗涨法和冻融法分别获得约14条和6条蛋白质条带，前者提取出了大于50kDa的蛋白并且比后者多出一条约25kDa的蛋白。这四种方法获取蛋白质条带数量不同，但具有分子量几乎相同的条带。通过比较得知，三氟乙酸法和SDS煮沸法提取的孢子表面蛋白分子量较小，蔗糖渗涨法和冻融法提取的孢子表面蛋白除分子量20kDa以下的蛋白外还能够提取较大分子量的蛋白。根据GenBank中注册的5种疏水蛋白基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增得到轮枝镰孢的5种疏水蛋白基因，构建了基因重组酵母表达载体，转化酵母菌株GS115后筛选获得酵母工程菌株，将上述工程菌株进行诱导表达并纯化表达产物。五种疏水蛋白分别对兔血红细胞、轮枝镰孢（F.verticillioide）孢子、九州镰孢菌（F. kyushuense）的孢子以及纤细齿梗孢（O. tenellum）的孢子进行凝集反应，结果表明五种蛋白都具有明显的凝集活性。Ⅱ型疏水蛋白Hyrophobin4和Hyrophobin5能够诱导玉米防御反应酶的表达。为了深入研究寄生性真菌纤细齿梗孢对轮枝镰孢的初始分子识别机制，本实验将轮枝镰孢（F.verticillioide）五种疏水蛋白基因进行敲除，采用PEG介导转化法，经过潮霉素抗性筛选，成功获得了FvHYD2 和FvHYD5基因缺失的突变体，2个突变体在菌落形态、生长速度、产孢、致病性方面与野生菌株有明显差别。通过以上的研究工作，表明了轮枝镰孢五种疏水蛋白具有凝集活性，说明疏水蛋白在两种真菌的分子识别上发挥着一定作用，这些研究为菌寄生真菌的初始分子识别机制的研究提供了新的思路。