WRKY基因在石斛菌根形态发生过程中的分子调控机制

本课题组在前期研究珍稀药用兰科植物石斛菌根形态发生分子机制过程中，利用基因组学和分子生物学技术发现WRKY基因转录表达发生了明显变化，推测WRKY基因对石斛菌根形成可能具有重要的调控作用。因此，本项目拟以cDNA文库和RACE技术克隆石斛根部器官定位的WRKY基因全长cDNA，利用CymMV病毒介导的瞬时表达和RNAi研究WRKY基因在石斛菌根形态发生过程中的功能，并利用基因芯片和蛋白质组学技术分析植物-菌根菌相互识别过程中参与菌根形态发生的DcWRKY(n)转录因子和下游基因以及其调控网络，揭示菌根形态发生的分子机理，为进一步人工模拟利用该机理，增强共生菌与宿主植物共生菌根形成能力，获得最佳的菌根共生体系，使其在农业和自然生态系统中发挥更大的作用，提高石斛对养分吸收效率，加快生长速度和促进生产规模化，推动石斛产业发展，发展效益农业和增加农民收入，提供重要的理论基础。

在前期建立菌根体外共生系统的基础上，构建了铁皮和金钗石斛两个cDNA文库。利用这两个文库开展了共生菌条件下转录因子类基因的表达调控机理研究。研究发现，石斛菌根共生能够提高石斛幼苗成活率并能提高抗逆性，在这个过程中，WRKY、EREBP和MYB类基因表现明显变化，推测以上基因可能其参与了菌根形态发生及石斛对逆境适应。. 克隆了WRKY11和WRKY29两个基因,并在烟草通过过表达对其功能进行验证。相对于野生型，DnWRKY29 转基因烟草种子和幼苗对盐和干旱胁迫更敏感。种子的发芽率，幼苗的根长和转基因烟草的鲜重均低于野生型。过氧化氢酶，过氧化物酶、超氧化物歧化酶在转基因烟草均降低，而丙二醛含量在转基因烟草中增加。此外，盐和干旱胁迫下，DnWRKY29 基因在石斛幼苗中上调，这与烟草过量表达的功能鉴定一致。推测DnWRKY29基因参与了植物的胁迫应答反应，且初步断定DnWRKY29因子在此过程中是一个负调控子。与野生型相比，DnWRKY11转基因烟草种子和幼苗较耐干旱和盐胁迫，转基因烟草种子的发芽率明显高于野生型。转基因烟草幼苗的根长比野生型长，鲜重均高于野生型。转基因烟草幼苗表现出较高的过氧化氢酶，过氧化物酶，超氧化物歧化酶，而丙二醛含量较低。表明WRKY11对烟草抗逆具有正调控作用，能够促进植株根长，证实WRKY11对植物根发育具有重要的调控作用，参与了石斛根形态的发生。. 克隆了菌根形态发生相关转录因子类基因DoEREB5 和DnCPL，进行了表达及功能研究。DoEREB5对叶绿素合成有一定的抑制作用。荧光定量分析表明，DoEREB5的过表达会导致拟南芥同源基因ERF9表达量出现一定程度的降低，推断DoEREB5可能与同源基因ERF9存在功能互补。在RNAi拟南芥植株中DoEREB5表达导致拟南芥同源基因ERF9的表达量出现明显降低，说明DoEREB5能够明显干涉拟南芥同源基因ERF9的表达；过量表达DnCPL的转基因拟南芥表型刺毛明显减少甚至没有；对其进行RNAi的植株还有少许的刺毛，初步判断此转录因子可能与刺毛的形态建成有关；与此同时在根毛的发育上，过量表达DnCPL的转基因拟南芥表型根毛明显变长增多，RNAi的植株只有少许的根毛，判断此转录因子可能与刺毛和根毛的形态建成有关。