b-HLH转录因子在响应MeJA和SA诱导白桦三萜合成中的功能及调控机制

Betulinic acid and oleanolic acid of triterpenoid in bark of Betula platyphylla suk had an important pharmacological activity against HIV, and tumor.. Before we had cloned the key enzyme genes in triterpenoid synthesis path and the bHLH transcription factors involved in MeJA/SA signal pathway. Then the project aim to identify the interaction between the transcription factor bHLH and the key proteins in triterpenoid MVA pathway through the bioinformatic analysis of bHLH transcription factors and yeast one hybrid system. Also we intend to verify the protein interaction by Y2H, BiFc and Pull down technology. Subsequently the expression characteristics of bHLH transcription factor and interaction protein in MVA pathway,using expression pattern under abiotic stress, subcellular localization and tissue specificity expression analysis. Therefore employing abiotic stress treatment, the molecular function and regulation mechanism of b-HLH transcription factors in response to MeJA and SA induced triterpenoid synthesis of Betula platyphylla suk would be elucidated through the photosynthetic characteristics, physiological resistance, triterpenoid accumulation and endogenous hormone synthesis in transgenic Betula platyphylla suk with over-expression and inhibition expression of the bHLH.This research would provide important gene resources and theoretical basis for utilizing the triterpenoids of Betula platyphylla and clarifying the triterpenoid metabolism regulation network.

白桦外皮中的白桦脂酸、齐墩果酸三萜物质具有重要的抗艾滋病毒、抑制肿瘤的药理活性。本申请项目依据前期已克隆白桦三萜合成关键酶基因及获得的参与MeJA/SA信号途径的bHLH转录因子的基础上提出的。拟通过对bHLH转录因子生物信息学分析及酵母单杂交技术鉴定bHLH转录因子与下游三萜MVA途径关键蛋白互作关系，并通过Y2H、BiFc和Pull down技术验证互作蛋白。通过非生物胁迫表达模式、亚细胞定位和组织表达特异性分析，明确bHLH转录因子与MVA途径互作蛋白的表达特性。结合非生物胁迫诱导，通过分析bHLH超量及抑制表达转基因白桦的光合特性、抗逆生理、三萜积累及内源激素合成，阐明b-HLH转录因子在响应MeJA和SA诱导白桦三萜合成中的分子功能及调控机制。该研究将为药用白桦遗传改良提供重要基因资源，其开展将为白桦三萜类物质的生物技术利用和丰富三萜代谢调控网络提供理论支撑。

白桦树外皮中的白桦酯酸类三萜成分被证实具抗艾滋病毒和抑制肿瘤的药理活性，且低毒而高效，被誉为最有潜力的新型药物制剂，其进一步开发、利用意义重大。但因其合成少，含量低，制约其进一步实际应用。. 本项目前期明确诱导子MeJA、SA对白桦三萜有显著的诱导效应，为了深入探讨响应MeJA、SA信号途径的转录因子bHLH对白桦三萜的调控机制，克隆了响应MeJA、SA信号的7个bHLH转录因子基因和2个MYB转录因子基因，明确其组织表达特性及对激素诱导表达模式；完成7个转录因子基因和6个白桦三萜合成MVA途径关键酶基因及5个后修饰氧化酶CYP450启动子克隆、序列分析、活性鉴定；并鉴定5个bHLH和2个MYB转录因子基因功能及对白桦三萜合成的调控作用；同时利用酵母单杂交实验鉴定了bHLH、MYB转录因子基因与三萜合成MVA途径关键基因、催化三萜共同骨架的OSC酶基因及CYP450的互作关系。研究结果明确BpbHLH9受MeJA、GA和ABA诱导上调表达，并通过调控三萜途径关键酶基因表达促进三萜前体角鲨烯及三萜组分含量提高，特别是可以显著促进BPY基因表达及其产物齐墩果酸含量的提高。同时发现，BpbHLH15基因是三萜合成途径重要功能基因，其缺失将导致三萜合成严重受阻，并与白桦植株短柄腺毛发育相关，同时在叶绿素合成及延迟植株衰老方面发挥重要功能。BpMYC4、BpbHLH2、BpbHLH3基因具有促进酵母总三萜合成的能力，同时在抵抗盐碱胁迫中发挥重要作用，其中BpMYC4、BpbHLH3分别对NaCl和Na2CO3表现较强耐受性。明确BpMYB21和BpMYB61通过结合BpSE和BpX启动子的MBS元件调控BpSE和BpX的表达，进而调节三萜类化合物的合成，不同的是BpMYB21正调控白桦脂酸、白桦脂醇含量提高，而BpMYB61作用相反。BpbHLH2基因可通过结合BpMYB21启动子序列，同BpHMGR、BpSE及BpCYP450基因互作参与调控三萜合成，且这种调控作用受MeJA和SA诱导。. 该研究为药用白桦遗传改良和通过合成生物学手段进行白桦脂酸类抗肿瘤药物活性成分生产提供重要基因资源、技术支持和理论基础，该研究结果也极大丰富了白桦树中三萜代谢调控网络，具有重要的理论价值和应用前景。