曲霉型豆豉发酵微生物优势菌群分析及代谢机理研究

Aspergillus-type douchi is a Chinese traditional flavouring agent, which has the advantages of rich nutrition and unique flavor. However, the aspergillus-type douchi fermentation is spontaneous fermentation, which is relative backward comparing with other food fermentation, and results in unstable fermentation quality and easily introducing pathogen. Although there were many problems existing in the traditional aspergillus-type douchi, the researching contents as follow: using high-throughput metagenome sequencing to investigate the microbial diversity in the whole douchi fermentation process, COG functional prediction, KEGG metabolic pathway, carbohydrate-active enzyme prediction ; Using GC-MS technology to investigate the functional components in the whole douchi fermentation process; Digging the functional key bacteria in douchi fermentation process then using them for pure breed douchi fermentation; Building the correlation between the functional key bacteria and the flavor compounds by establishing the mathematical model to investigate the rule of the formation of quality and the flavor compounds in douchi fermentation.

曲霉型豆豉是中国传统的调味品，具有营养丰富、风味独特等优点。目前，曲霉型豆豉生产方式仍然是生产工艺落后的传统自然发酵，这会导致产品品质不稳定、发酵过程易引入致病菌等问题。针对传统曲霉型豆豉存在的问题，研究以下内容：采用高通量宏基因组测序技术分析豆豉在发酵过程中微生物多样性、COG功能预测、KEGG代谢通路、碳水化合物活性酶的预测；采用GC-MS分析豆豉发酵过程中功能物质成分；挖掘曲霉型豆豉在制曲和发酵过程中的关键功能菌及豆豉纯种制曲和发酵；建立功能关键菌与活性物质代谢控制数学模型，研究豆豉品质形成规律，为建立曲霉型豆豉风味与微生物多样性及其代谢机理提供理论依据。

曲霉型豆豉是中国传统的调味品，具有营养丰富、风味独特等优点。（1）本项目对豆豉自然发酵过程中的微生物群里进行动态分析及功能优势菌的筛选和鉴定，并对纤溶酶产生菌的纤溶酶发酵工艺条件进行优化及对纤溶酶进行纯化和表征。通过高通量测序技术得到8个细菌门和3个真菌。采用平板分离技术成功分离得到产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌、产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌、产酒精和产香的酵母菌、产乳酸的乳酸菌等。重点对其中一株高产纤溶酶的菌株产纤溶酶的发酵条件进行了优化。（2）本项目对豆豉发酵过程中的理化性质、细菌微生物多样性及功能风味物质进行动态分析，并对风味物质与细菌微生物的相关性进行系统的研究，为曲霉型豆豉纯种工业健康标准化生产奠定了理论基础。氨基酸测定仪测定豆豉样品发酵过程中的氨基酸总共有16种，GC-MS测得豆豉样品发酵过程中共有42中挥发性成分，HPLC法测定了豆豉发酵过程中大豆异黄酮含量的变化。利用O2PLS分析了豆豉发酵过程中42种挥发性物质和16种游离氨基酸与细菌微生物菌属之间的关联情况。发现具有对风味有重要影响的细菌微生物有57个属，并找到了9种核心功能菌。（3）本项目通过从豆豉发酵阶段的品质及酶系等指标切入，结合多种工具从绝对及相对丰度两个角度，阐明了造成豆豉品质指标改变的重要源头即微生物的变化规律，并结合培养试验对优势微生物的环境耐受及发酵潜力完成初步评价。豆豉发酵温度为先升后降，大多数阶段在45˚C上下，pH持续下降至结束时4.86。豆豉发酵中含盐量维持在6%左右，氨基氮及总酸呈稳步上升的趋势，而还原糖及总糖的含量呈持续下降的趋势。豆豉发酵阶段细菌占绝大多数，细菌、乳酸菌及真菌的丰度均呈下降趋势，基于实时定量PCR试验，发现细菌及真菌的绝对丰度随着发酵的进行明显下降，细菌绝对丰度始终领先真菌2~3个数量级，葡萄球菌属绝对丰度自第10天起急剧下降，芽孢杆菌属整体的波动不明显。对优势菌进行胁迫环境试验，发现魏斯氏菌、乳酸杆菌胁迫环境耐受性较弱，4种菌属高温耐受能力均不强，而对盐分、低pH等因子均具有一定耐受性，其中葡萄球菌属在6%盐分生长基本不受影响。这将为更深入地探索曲霉型豆豉的发酵规律提供了研究思路，并为下一步复配发酵建立了试验基础。