铜绿假单胞菌群体感应系统相关sRNA的筛选鉴定及其对耐药基因接合性转移的调控作用

Conjugation plays a critical role in horizontal transfer of antibiotic resistance genes between bacteria. Conventionally, conjugation is considered to be mainly regulated by the self-transmissible plasmids. However, using an E. coli-P. aeruginosa conjugation model, we recently found the important function of P. aeruginosa quorum sensing (QS) signaling molecule HSL on conjugation. Moreover, when P. aeruginosa was exposed to antibiotic stress that could be alleviated by conjugative transfer of a resistance gene from the donor E. coli strain, the mRNA expression of HSL-producing genes lasI and rhlI were downregulated. Subsequent bioinformatics analysis indicated that small non-coding RNA (sRNA) might be involved in lasI and rhlI expression regulation, suggesting sRNA may provide a mechanism for conjugation regulation. With these findings as background, we will combine the bioinformatics methods and experimental studies to further confirm: 1) the regulation of sRNA in QS system and its underlying mechanisms; 2) the function of QS sRNA in conjugation; 3) the role of QS sRNA in antibiotic-induced conjugation. The results obtained will not only provide new insight into an important contribution of QS sRNA to the networks that regulate conjugation, but also provide the molecular basis to develop new strategies for preventing antibiotic resistance.

接合是基因水平转移的主要方式，导致耐药基因在细菌间广泛播散。既往针对接合的研究主要局限于质粒携带的调控元件，不能完全阐释接合的复杂机制。前期发现铜绿假单胞菌群体感应(QS)信号分子HSL具有抑制大肠埃希菌-铜绿假单胞菌接合的重要功能。并发现在抗生素胁迫下，HSL合成酶LasI、RhlI基因表达显著下调，接合频率增高，但机制不明。生物信息学分析提示lasI、rhlI等可能受细菌非编码小RNA(sRNA)调控。我们推测，抗生素胁迫下铜绿假单胞菌sRNA表达发生变化，通过下调QS信号分子促进接合，是接合调控的重要机制。本课题拟以接合反应受体菌铜绿假单胞菌为研究对象：①转录组测序研究抗生素处理下铜绿假单胞菌表达变化的sRNA；②筛选并鉴定QS相关sRNA；③过表达和基因敲除候选QS相关sRNA，明确其对QS和接合的调控作用，揭示细菌接合调控的新机制，为发展阻断耐药基因接合转移的抗菌新策略提供依据。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）是医院常见的条件致病菌，常感染肿瘤、严重烧伤、囊性肺纤维化及各种免疫力低下患者，由它引起的临床感染率高达20%以上。P. aeruginosa具有强大的先天及获得性耐药能力，给临床治疗带来极大困难，因此深入探究P. aeruginosa的耐药机制具有重要的科学价值和临床意义。本课题组前期利用大肠埃希氏菌（E. coli）-铜绿假单胞杆菌（P. aeruginosa）接合模型研究发现，群体感应（QS）系统可能是P. aeruginosa调控耐药基因接合转移的重要机制。为了进一步明确QS系统的调控机制，本研究以具有基因转录后表达调控功能的细菌非编码小RNA(small non-coding RNAs, sRNAs)为切入点：（1）利用生物信息学、基因转录组测序及qRT-PCR筛选出群体感应系统相关sRNA PrrH、P26、P5316.1、P34、P30及AmiL；（2）通过基因过表达及敲除、毒力因子检测、血流感染模型及接合模型等试验，发现PrrH抑制铜绿假单胞菌绿脓素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂等毒力因子的合成及血流感染能力，其表达下调可能与铜绿假单胞菌感染密切相关，其表达上调则可能是抗生素作用下铜绿假单胞菌通过接合获得耐药基因的重要机制；（3）利用生物信息学方法结合报告系统、qRT-PCR等试验，鉴定了PrrH新的靶标分子PhzC/D及转录因子RhlR，首次明确了RhlI/R-PrrH-LasI/PhzC/PhzD信号通络。以上研究结果丰富了QS调控网络并揭示了sRNA新的生物学功能，这为发展基于QS系统和sRNA的抗菌策略提供了实验室依据，具有较高的科学意义和临床价值。