cry2对小地老虎生物钟和昼夜节律的调控机制

Agrotis ipsilon, a serious underground pest with seasonal migration, exhibits distinct nocturnal activity rhythms. However, its circadian clock mechanism is still unclear. In this project, the genome editing technique CRISPR/Cas9 will be employed to study the function of cry2, a major regulatory gene of the clock feedback loop, in A. ipsilon. We will develop a highly efficient gene-targeting approach for germline and establish homozygous cry2 knockout lines, by which we can analyze the influence of cry2 on per, tim and other clock genes and a series of behavioral rhythms, like eclosion, mating and oviposition. Further more, we will compare the molecular clocks of diurnal and nocturnal lepidopteran insects to find the relationships between clock rhythms and behavioral rhythms. This work will contribute to the in-depth studies of circadian clock mechanisms in other lepidopterans, it will also provide insights into the genetic basis of insects migration and novel strategies of pest control.

小地老虎是一种重要的地下害虫和迁飞性害虫，具有典型的夜出性行为，但目前尚无关于小地老虎生物节律调控机制的报道。本项目拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对节律反馈环路核心调控基因cry2在小地老虎中的功能进行研究，通过探索高效的生殖细胞基因编辑方法，建立内源节律调控元件CRY2缺失的纯合突变品系，用于分析cry2对per、tim等生物钟基因的调控作用及对羽化、交配、产卵等行为节律的影响，以此阐明小地老虎的昼夜节律调控机制。此外，我们将进一步比较鳞翅目昼出性类群与夜出性类群生物钟系统的差异，分析可能导致行为节律差异的原因。本项目不仅有助于鳞翅目其它类群节律调控机制的深入研究，对探索昆虫迁飞机制和开发新的害虫防治策略也具有重要意义。

小地老虎是重要的地下害虫和迁飞性害虫，具有典型的夜出性行为，目前尚无关于小地老虎生物节律调控机制的报道。脊椎动物型隐花色素基因cryptochrome（cry2）被推测为帝王蝶生物钟的转录抑制因子，对生物节律的调控可能具有重要作用。我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对小地老虎的cry2基因进行了敲除，并构建了纯合突变品系。通过比较cry2纯合突变体和野生型小地老虎在行为节律和基因表达时相的差异，我们发现cry2突变会导致成虫白天羽化的数量显著增加，核心钟基因period（per）和timeless（tim）的表达时相也发生紊乱，由此证明，cry2的缺失可造成内源生物钟被破坏，从而引起行为节律的改变。通过比较不同物种的生物钟系统，我们发现鳞翅目昆虫具有相对保守的生物节律调控系统。此外，核心钟基因per、tim及cry2在昼出性昆虫帝王蝶和夜出性昆虫小地老虎中的表达时相相似，而果蝇型cryptochrome基因（cry1）的表达节律在两种昆虫中相反，有关两者行为节律差异的关键调控元件还有待于进一步研究。本项目成功建立了小地老虎基因编辑体系，对小地老虎其它基因的功能研究具有借鉴意义。此外，生物钟核心调控元件cry2的功能研究还有助于鳞翅目其它类群节律调控机制的深入探索。