静电自组装纳米三元复合体基因转染机理的研究

磁转染（Magnetofection）是备受关注的新型基因转染技术。然而，关于转染复合体的构建尚无理论指导；关于转染复合体对转染效率的影响规律及机理并不清楚。基于用静电自组装方法构建的三元复合体可成功转染多种细胞的前期工作，我们提出纳米磁粒-载体-基因三者之间的结合稳定性必须达到一定的平衡才能保证纳米磁粒在细胞内外能可控运送并释放基因。本项目拟选择COS-7和NIH-3T3细胞为模型，在聚乙烯亚胺与纳米磁粒用不同结合方法构建的转染复合体的基础上，通过研究不同复合体的稳定性对其细胞内吞途径、在细胞内的命运及转染效率的影响来证实我们的载体构建理论的正确性。本项目对于揭示转染复合体的构建方法对基因转染效率的影响规律及其机理具有重要的学术价值；对于指导合成、构建更高效的基因载体具有重要指导意义；对于进一步提高磁转染的效率、推广磁转染技术具有具有重要应用价值。

本项目按计划顺利完成，发表SCI论文4篇，培养博士生1名。.本课题主要包括三部分内容，1、研究了不同电性的纳米磁粒构建的磁转染三元复合体的转染可行性，并且进一步用不同载体、不同细胞进行对照研究。2、研究了磁转染的机理并提出了构建磁转染载体的原则。3、研究了GSSG-MNPs的细胞内吞机理。.1、研究不同电性的纳米磁粒构建的转染复合体的转染可行性 .本实验在合成表面带不同电荷的MNPs（MNPs-PEI，MNPs-CA，MNPs-CMD）的基础上，进一步证实：.1）磁转染三元复合体能够通过静电自组装作用构建得到；.2）不仅带正电的磁粒可以与载体及DNA组装成转染复合体，带负电的磁粒也可以与载体及DNA组装成转染复合体；.3）自组装转染三元复合体能够提高PEI或脂质体的基因表达水平和/或阳性细胞表达率；.4）转染时间大大缩短，使实验过程更为简便。.以上结果对于提高非病毒载体的转染效率具有重要的指导意义。.2、转染机理的证明.设计三元复合体（载体PEI、共价修饰PEI的纳米磁粒、pDNA），通过电泳实验研究复合体的稳定性，通过TEM及共聚焦显微镜观察研究三元复合体在细胞内的命运并提出假设，然后，通过转染实验证实了转染复合体在细胞内的转染机理。.结果表明：.1）纳米磁粒在转染过程中没有进入细胞核，它起的作用只是把转染复合体拉到细胞表面；.2）pDNA/PEI复合体在进核之前必须先与MNPs-PEI分开，否则无法进核；.3）当磁转染三元复合体中没有自由PEI的时候，SPC-A1及COS-7细胞都没有转染成功。如果调节磁转染三元复合体三组分的配比将会获得不同的转染结果。.以上结果表明磁转染三组分之间存在一个最优的组合。转染复合体三个组分之间必须要达到一定的平衡，既要保持一定的紧密度使三者不易分开，以在磁场力作用下拉到细胞表面，又要使得PEI/pDNA能够在细胞内脱离MNPs-PEI。.此发现对于磁转染复合体的构建具有指导意义，为进一步构建更高效的转染复合体奠定了理论基础。.3、研究了GSSG-MNPs的细胞内吞机理