裂殖酵母RNA甲基转移酶SPAC1002.08c的作用机理

本项目将重点利用RIP-CHIP生物芯片的新技术在裂殖酵母的全基因组中寻找RNA甲基转移酶SPAC1002.08c在细胞中所有的底物RNA，利用甲基转移酶活性分析的方法在体外验证底物RNA的真实性，在知道了特定底物RNA的条件下，进一步揭示RNA甲基转移酶和底物RNA的识别机制和作用机理，为能够更深入和更全面地了解RNA修饰的生物学功能提供了新的思想方法和技术路线。

裂殖酵母甲基转移酶SPAC1002.08c到目前为止在体外无法检测到RNA甲基转移酶活性，但是我们发现裂殖酵母甲基转移酶SPAC1002.08c又是线粒体转录因子Mtf1。本课题组首次分离和鉴定了裂殖酵母线粒体转录组分RNA聚合酶（Rpo41）和转录因子（Mtf1）并在遗传和生化上揭示了Rpo41和Mtf1在线粒体转录中的生物功能。我们首先构建了Mtf1和Rpo41的敲除菌株。敲除Mtf1 或者Rpo41的细胞不能形成菌落也不能在液体培养基中生长；观察单倍体细胞发现，敲除Mtf1和敲除Rpo41细胞的表型是相似的：细胞变长，出现“酒瓶”或“鸡蛋”的形状。荧光染色后发现敲除Mtf1或者Rpo41后，细胞的横隔分离异常，细胞核异常，线粒体膜电位降低。敲除Rpo41或Mtf1可以使线粒体基因组基因的转录降低，而过表达Rpo41或Mtf1可以使线粒体基因的转录增加。我们表达和纯化了裂殖酵母的Rpo41和Mtf1来进行体外实验。用EMSA的方法证明了Mtf1和Rpo41与线粒体启动子有结合。在体外，Rpo41和Mtf1能转录线粒体启动子，并且Mtf1能提高转录效率。对于体外转录合成的RNA的5’-RACE分析表明，体外转录起始位点和体内是一致的。这些实验结果发表在Nuclear Acid Research （2011 Jul1;39(12):5119-30）并且在研究的深度，完整性和创新性上被评为NAR 优秀论文（top 5% featured article）。. 我们还发现了Mtf1 的一个全新的功能，我们进一步用ChIP-chip的方法在裂殖酵母全基因组中找到了Mtf1在核中作为转录因子的靶基因，其中Srk1（参与细胞胁迫和细胞周期）是芯片数据中的第一个靶基因。我们接下来用5’RACE确认了Srk1启动子的转录位点，在体外用生化的方法（EMSA）证明了srk1的上游序列在体外和纯化的Mtf1有结合，我们还发现Mtf1的细胞功能可能与细胞周期的调控有关, 这些实验结果也已在Nucleic Acids Research (2011 Apr;39(7):2690-700）发表。. 我们发现Mtf1作为裂殖酵母线粒体转录因子可以与HSP60分子伴侣相结合来实现其在线粒体中的功能，结果已经发表在Genes to Cells 上发表(2012) 17, 122–13。