固氮施氏假单胞菌非编码RNA crcZ和crcY在碳代谢抑制中的协同作用机制

The Pseudomonas is widely distributed in nature and carbon catabolite repression (CCR) is an important regulatory mechanism that allows microbes to select the best carbon source to adapt to the complex environment. In Pseudomonas, the Crc protein is the core of the CCR regulatory net, and its activity is regulated by the non-coding RNA crcZ, but the mechanism is unclear. Pseudomonas stutzeri A1501 is a nitrogen-fixing bacterium associated with rice. In addition to the Crc-crcZ system in A1501, a homologue of crcZ, named crcY, was found. Our research showed that the expression characteristics of crcZ and crcY are different, implying that they may be have different biological divisions, and suggesting that further study of the mechanism is needed. We will employ the following research: 1) To define the regulatory model for crcZ and crcY expression in carbon mechanism regulatory net by qRT-PCR and EMSA; 2) To define the molecular mechanism of crcZ and crcY involved in glucose CCR of benzoate degradation by protein-RNA interaction; 3) To explore the cooperation mechanism of crcZ and crcY in carbon catabolite repression by functional complementation and Northern blot. This work will lay an important theoretical foundation for revealing the molecular mechanism of associate nitrogen –fixing microbial carbon metabolism.

假单胞菌在自然界广泛分布，碳代谢抑制作用是其利用优势碳源、适应复杂环境的重要机制。Crc蛋白是假单胞菌碳代谢抑制调控的核心，非编码RNA crcZ可通过与Crc的竞争性结合影响其调控活性。固氮施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际，除Crc-crcZ系统外，该菌中还存在一个与crcZ同源的crcY，初步研究表明crcY和crcZ具有不同的时空表达特性，可能具有不同的生物学功能，其作用机制未知，值得深入研究。本研究拟以A1501菌苯甲酸代谢抑制为模式，开展以下工作：1）实时定量及凝胶阻滞实验明确crcZ、crcY的表达模式；2）蛋白-RNA互作技术研究crcZ、crcY与Crc蛋白的互作机制；3）功能互补、Northern杂交探讨非编码RNA在碳代谢抑制调控中的协作机制。本研究为揭示联合固氮菌碳代谢调控的分子机制奠定重要理论基础。

碳代谢物抑制（CCR）是指当环境中存在多种碳源时，微生物优先利用优势碳源而抑制非优势碳源的利用从而达到最佳生长的现象。假单胞菌中的碳代谢物抑制调控系统由双组份系统CbrAB、碳代谢物抑制蛋白Crc以及非编码RNA（CrcZ、CrcY或CrcX）组成。固氮施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际，除Crc-CrcZ系统外，该菌中还存在一个与CrcZ同源的CrcY，初步研究表明Crc-CrcY/CrcZ在葡萄糖对苯甲酸的代谢抑制过程中发挥着重要的功能，其中CrcY和CrcZ在碳代谢抑制过程中是否具功能互补性以及其分子作用机制目前仍未知。.本研究通过实时定量及凝胶阻滞实验明确CrcZ、CrcY的自身表达模式，研究结果表明CrcZ和CrcY都是RpoN依赖型的受二元系统CbrA/CbrB调控的非编码RNA；利用qRT-PCR对不同碳源生长条件下crcZ和crcY的信号响应特性进行比较分析，结果表明在苯甲酸中， crcZ和crcY的总量高于LB中对数期，但是在葡萄糖中的表达量极低，推测在苯甲酸和葡萄糖混合碳源条件下，在苯甲酸诱导条件下高表达的CrcZ和CrcY与碳代谢抑制蛋白Crc结合，解除Crc对苯甲酸利用基因 benR mRNA的抑制；固氮酶活测定表明单独缺失crcZ或crcY几乎不影响菌株的固氮酶活性，但crcZ/Y双突变株的酶活值仅为野生型的一半，表明CrcZ和CrcY在固氮调控过程中可能也存在功能互补性；利用微量热涌动仪（MST）在体外进一步证实了Crc蛋白能够特异性地与CrcZ/Y、benR mRNA之间相互作用。.综上所述， CrcZ和CrcY在P. stutzeri A1501的碳代谢抑制和生物固氮的调控过程发挥着重要的正调控功能，两个非编码RNA之间存在功能互补性。在葡萄糖对苯甲酸的代谢抑制的过程中，CrcZ/Y通过与Crc的相互作用解除Crc蛋白对苯甲酸代谢基因benR mRNA的抑制作用。课题执行期间共发表期刊论文9篇，其中SCI收录2篇，中文核心期刊3篇；申请发明专利5项。参加国际学术会议1次，国内学术会议1次，在中国生物工程学会第十一届学术年会暨 2017 年全国生物技术大会做学术报告。指导博士研究生2名，硕士研究生3名。本研究不仅将为微生物的碳代谢调控机制及碳氮偶联调控网络的深入研究奠定重要的理论基础，而且也为高效固氮菌的分子改造提供了理论依据。