去乙酰化酶抑制剂促进间充质干细胞成骨分化而抑制其成脂分化的分子机制研究

A reciprocal relationship between osteogenesis and adipogenesis is the characterization of osteoporosis, which is due to an imbalance between the osteogeneic and adipogenic differentiation potential of meshenchymal stem cells (MSCs). However, the underlying mechanism of this modulation is uncertain. In the past five years, acetylation has been proved to be a regulatory modification to rival phosphorylation. The different effects of histone deacetylase inhbitors (HDACis) on MSCs differentiation, promotion of osteogesis and inhibition of adipogeneis, were validated by recent reports and our previous studies. In the present study, in vitro adipogenic and osteogenic differentiation models were established by using C3H10T1/2, a mouse mesenchymal stem cell line. High-throughput comparative proteomic analyses based on isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) labeling combined with antibody enrichment of acetylation peptides and online two-dimensional nanoscale liquid chromatography and tandem mass spectrometry were performed to analyze the effects of SAHA on proteome and acetylome of adipogenic and osteogenic differentiated C3H10T1/2. By further bioinformatics analyses and biological validation, we hope to reveal the molecular mechanism underlying the different effects of HDACi on MSCs differentiation from two aspects: protein expression and protein acetylation, whereby to deepen our knowledge of Acetylation Biology and to improve the understanding and treatment of the disorders characterized by decreased bone formation and increased adipogenesis.

骨质疏松等疾病中骨与脂肪组织"此消彼长"的现象与间充质干细胞（MSCs）定向分化调控失衡有关，但分子机制不明。近年来，可逆的乙酰化修饰已被证明是一种匹敌于磷酸化的蛋白质翻译后修饰方式。我们前期的研究和近年的相关报道均表明去乙酰化酶抑制剂（HDACiｓ）可促进MSCs成骨分化而抑制其成脂分化。本课题拟建立小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2成脂、成骨的体外分化模型，通过基于稳定同位素iTRAQ和SILAC标记、抗体富集乙酰化肽段并结合LC/MS/MS的定量蛋白质组学方法，分别检测成脂、成骨分化过程中HDACi SAHA对C3H10T1/2细胞全蛋白表达谱和蛋白乙酰化修饰水平的影响，结合生物信息学分析和生物学验证，从蛋白表达和乙酰化修饰两方面探讨HDACi调控MSCs定向分化的分子机制，为预防和治疗此类疾病提供新的思路和途径,为加深对乙酰化生物学的认识和HDACis类药物的开发提供实验基础。

近年随着质谱技术和蛋白质组学研究方法的进步，发现了越来越多的可以被乙酰化修饰的蛋白质和蛋白位点。除了通过修饰组蛋白而作为一种表观遗传的调控方式，越来越多的研究发现大量的非组蛋白可以被乙酰化修饰，从而参与细胞的代谢调节，但对于不同蛋白质乙酰化修饰的位点和修饰水平仍然有待阐明。本研究以成脂分化的间充质干细胞作为研究模型，通过定量蛋白质组学和乙酰化肽段的亲和层析的方法，系统分析了成脂分化过程中蛋白和蛋白质乙酰化表达谱的变化。我们发现：1.随着成脂分化时间的延长，间充质干细胞乙酰化的水平整体上呈增加的趋势，2成脂分化间充质干细胞中显著增加的蛋白主要参与了能量和脂肪酸代谢，与成脂分化过程一致，而下调的蛋白主要是与细胞周期相关的蛋白，反映了成脂过程中细胞的增殖被抑制。3. 与WB结果一致，大部分具有定量信息肽段（584 in 957）的乙酰化程度在成脂分化过程中是增加的，与这些肽段相对应的蛋白主要参与了能量代谢和脂肪酸代谢，此外，组蛋白H2，H3和H4的乙酰化水平也是增加的。乙酰化水平下降的肽段主要来自于细胞核蛋白，尤其值得注意的是具有乙酰转移酶的活性3个核蛋白，CBP，KAT6和Jade2。4. 通过与全蛋白定量结果的比较，蛋白乙酰化程度的增加可能来自于两个方面，一方面是蛋白表达水平的增加，另一方面则是蛋白乙酰化水平的增加。上述研究结果从不同层面证实了，HDACi的处理可以增加蛋白质乙酰化水平，提高细胞的代谢水平，进而促进间充质干细胞的成脂分化。但与正常的成脂分化相比，仅通过增加蛋白的乙酰化水平并不能实现完全的成脂分化，反映在乙酰化修饰肽段的数量和种类要少于成脂分化。总之，该研究首次将蛋白的乙酰化修饰与间充质干细胞成脂分化的调控联系在一起，并发现成脂过程伴随着蛋白乙酰化程度的增加，而增加蛋白的乙酰化水平又能部分促进成脂分化。本研究结果将增进对乙酰化生物学的理解，为预防和治疗此类疾病提供新的思路和途径。