应用蛋白质组学的方法研究弓形虫表面蛋白

弓形虫与宿主之间的相互作用是弓形虫研究领域的关键科学问题。其中弓形虫表面蛋白在弓形虫与宿主细胞的相互作用中扮演着重要的角色。因此，对弓形虫表面蛋白进行系统和全面的研究对我们深入了解弓形虫的感染与致病机理，发现关键的致病蛋白具有重要的科学意义。本课题将采用生物素标记技术结合蛋白质组学的方法对弓形虫表面蛋白进行集中和系统的研究。通过生物素标记纯化技术将弓形虫表面蛋白进行特异和完全的提取，在此基础上结合蛋白质组学的分离鉴定技术，以达到对弓形虫表面蛋白的系统研究，并期望发现一批新的弓形虫表面蛋白。然后我们将进一步研究这些表面蛋白与宿主蛋白之间的相互作用关系。此外，本课题还将评价所获得的新弓形虫表面蛋白的免疫原性。对具有较好免疫原性的蛋白，将建立以此为基础的弓形虫临床检测方法。该研究不仅在弓形虫的基础研究方面具有重要意义，且可能为临床诊断提供帮助。

目的：应用蛋白质组学方法鉴定弓形虫表面和分泌蛋白，评价分离蛋白的抗原性，研究弓形虫表面和分泌蛋白与宿主组分的相互作用。方法：采用生物素标记、亲和素层析分离、液相色谱-两级质谱联用技术（LC-MS/MS）鉴定弓形虫速殖子表面和分泌蛋白；采用细胞因子抗体芯片和基因芯片技术评价分离蛋白激活宿主免疫细胞的能力；原核重组表达部分鉴定蛋白，采用Western-blot和免疫荧光等方法比较不同蛋白的抗原性；采用GST Pull-down技术鉴定与弓形虫表面和分泌蛋白互作的宿主组分，并采用过表达或RNAi技术研究蛋白互作与感染免疫的关系。结果：本研究共鉴定785个弓形虫表面和分离蛋白。分离蛋白刺激宿主巨噬细胞分泌的细胞因子水平显著高于弓形虫速殖子感染，且基因表达谱功能聚类与致病性大肠杆菌（EPEC）感染近似。重组蛋白与人源弓形虫患者血清免疫杂交表明部分鉴定蛋白抗原性较高，可用于弓形虫现症感染的诊断。弓形虫多个ROP和GRA分泌蛋白与宿主碳酸代谢酶类和tRNA转甲基酶类有显著蛋白互作，且免疫细胞碳酸酐酶过表达显著提高弓形虫繁殖速度。结论：弓形虫速殖子阶段表达的表面和分泌蛋白虽然少于基因组预测结果，但整体抗原性较高，可显著激活宿主固有免疫反应。宿主碳酸代谢酶类被弓形虫分泌蛋白捕获后直接或间接参与弓形虫的细胞内繁殖过程，可能与纳虫泡的形成和稳定性有关。