脊髓小胶质细胞P2X7R/Pannexin1激活NLRP3炎症小体通路在骨癌痛形成及维持中的作用机制研究

The activation of spinal NOD like receptor protein3(NLRP3) inflammasome is critical for induction and maintenance of bone cancer pain in microglia. Studies have shown that purine P2X7 receptor(P2X7R)-mediated activation of microglia involves in chronic neuropathic pain, and P2X7R activation can trigger NLRP3-mediated long-term mechanical allodynia. Pannexin1 acts as an important modulator of the neuroinflammatory response, by secreting ATP, by interacting with the P2X7R , and as an amplifier of NMDA receptor (NMDAR) currents, particularly in conditions of pathological neuronal hyperexcitability, additionally ATP stimulates pannexin 1 internalization to endosomal compartments ,although the precise molecular mechanism remains unclear. In this study, the mouse model of bone cancer pain was established to observe pain behaviors and spinal P2X7, Panx1,NLRP3 protein expression by technology of Western-blot, Real-time PCR and laser confocal immunofluorescence. The implementation of this research would investigate the regulation of NLRP3 inflammasome mediated by P2X7R/panx1 in the formation and maintenance of bone cancer pain and provide fundamental theory for the treatment of cancer pain in a novel perspective.

前期研究示脊髓背角NLRP3炎症小体的激活在骨癌痛中起重要作用，中枢神经系统嘌呤P2X7受体（P2X7R）介导的小胶质细胞活化参与了慢性病理性疼痛敏化的发生，而 P2X7R又可以触发NLRP3炎症小体介导的长时程机械痛觉异常。Pannexin1作为缝隙连接蛋白充当神经炎性反应的重要调节剂，通过分泌的ATP与P2X7R相互作用，并作为NMDA受体电流的放大器，参与病理神经元的过度兴奋；ATP的升高又可以反过来刺激Panx1内化到细胞内膜，参与NLRP3的激活，但P2X7R/Panx1对NLRP3具体调控机制仍未可知。本研究在小鼠骨癌痛模型上使用基因敲除、P2X7R、NLRP3拮抗剂的方法，通过行为学、Western-blot等技术观察骨癌痛小鼠痛行为学和脊髓背角P2X7R、Panx1、NLRP3蛋白表达变化，探讨P2X7R/Panx1介导的NLRP3活化机制，从而为骨癌痛提供精准镇痛靶点。

骨癌痛是晚期癌症患者常见的临床症状，严重影响生活质量，而现有治疗疗效有限。本研究在小鼠骨癌痛及细胞模型上，使用P2X7R拮抗剂、Pannexin1（Panx1）拮抗剂、小干扰RNA等方法，探讨脊髓小胶质细胞 P2X7R/Panx1介导的NLRP3活化机制在骨癌痛中的调节作用，为临床防治癌痛提供精准靶点。我们的研究结果显示： (1)骨癌痛小鼠脊髓背角P2X7R、Panx1、NLRP3、Caspase1及相关炎症因子IL-1β、IL-18在肿瘤细胞接种后10-21 d时表达显著增加，并在时相上与疼痛行为学结果基本一致，且Panx1与Ibal-1（小胶质细胞标记物）有表达共定位。(2)肿瘤细胞接种后第14 d单次鞘内注射不同剂量的P2X7R高选择性拮抗剂BBG后，中、高剂量组小鼠的NSF显著减少，PWMT显著增高。鞘内给药后2-8h疼痛行为学显著改善，4h作用达高峰，且存在剂量依赖性。而鞘内注射高剂量BBG能显著下调脊髓水平P2X7R、Panx1、NLRP3及下游信号分子的表达。本实验提示骨癌痛小鼠脊髓水平P2X7R可能通过影响 NLRP3及其下游信号通路参与骨癌痛的调节，BBG能够缓解骨癌痛行为学，且呈时间、剂量依赖性。(3) 肿瘤细胞接种后第14 d单次鞘内注射不同剂量的Panx1特异性拮抗剂10Panx后，中、高剂量组小鼠的NSF显著减少，PWMT显著增高，且高剂量组镇痛效果优于中剂量组。鞘内给药后1h疼痛行为学开始改善，2h达高峰，3 h后逐渐减弱，5h后消失。而鞘内注射高剂量10Panx显著下调脊髓水平P2X7R、Panx1、NLRP3及相关炎症因子的表达。以上实验提示P2X7R与Panx1在骨癌痛形成及维持中可能存在共调节。 (4)体外实验在原代小胶质细胞中证实P2X7R 与Ibal-1、Panx1 与Ibal-1存在共定位，ATP 处理12h后的小胶质细胞中 P2X7R、Panx1、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18等蛋白表达及ROS生成显著增加，Ca2+内流增多。 给予小干扰RNA si-Panx后能够下调Caspase-1、IL-18的表达，逆转ATP诱发的小胶质细胞中的伤害感受作用。综上：干预P2X7R/Panx1能有效缓解骨癌痛小鼠的痛觉过敏，可能是通过减少Ca2+内流、 ROS生成，抑制NLRP3活性进而减轻神经炎症反应机制。