枯草芽孢杆菌多胺合成途径产生的促生物质鉴定及其促生机理研究

The researches on the mechanisms of the growth promotion and biocontrol disease are the basis for efficient use of Bacillus spp. In our previous study, we demonstrated that Bacillus subtilis OKB105 could significantly promote plant root growth. But the mutation of yecA and speB, polyamine synthesis-related genes, can disrupt the growth-promoting activity of OKB105. Base on this result, we speculate that substance related to growth-promoting activity is derived from polyamines biosynthetic pathways. Till now, there is no publication related to this. This project will focus on the identification of promoting substances by site-directed mutagenesis, functional recovery, analysis and purification of the metabolite composition, nuclear magnetic resonance and other techniques and methods. At the same time, gene targeting and EMSA would be used to study the regulatory mechanism of this substance. To study the mechanism of action of the substance, Realtime PCR and Elisa technology will be used to detect the expression level of growth-related genes of plant and the level of plant hormones. This project would find out the new mechanism of interaction between plant and B. subtilis, and provide available genes for improving its biocontrol effect by gene engineering.

芽孢杆菌促进植物生长和防治植物病害机制的研究是其高效利用的基础。本课题组前期研究发现，枯草芽孢杆菌OKB105菌株具有很好的促生活性，而突变其多胺合成相关基因yecA和speB后，该菌株促生活性丧失。因此，我们推测这种促生物质来自多胺合成途径。迄今，尚未见类似的报道。本项目将突变多胺合成途径中的8个基因和6个调控基因，再进行功能恢复，对这些菌株代谢产物进行组份分析与分离纯化，并利用核磁共振等技术检测该物质的分子量与结构，从而鉴定该物质及其合成机理。同时，本项目将采用基因标记和凝胶阻滞电泳（EMSA）等方法和技术，解析芽孢杆菌调控该促生物质合成的机理。本项目还将采用Real time PCR和Elisa等技术，检测植物体生长相关基因的表达以及激素水平变化等，研究该物质的促生机制。本项目能揭示芽孢杆菌与植物互作的新机制，并为采用基因工程手段提高芽孢杆菌的生防效果提供可利用的基因。

项目前期发现枯草芽胞杆菌OKB105菌株具有很强的促进植物生长的作用，但这种促生作用不是由于产生目前已知的吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA）、细胞分裂素（Cytokinin）和赤霉素（Gibberellins，GAs）等植物激素类物质，但是其促生作用与多胺合成相关。本项目研究内容是对OKB105菌株多胺合成途径中的促生物质进行鉴定，研究其合成与调控机理，揭示该物质促生机制。通过筛选OKB105菌株突变体文库和基因定点突变，以及产物检测，我们首次鉴定和报道了芽胞杆菌OKB105促生物质为亚精胺（spemidine），亚精胺能够通过诱导扩张蛋白相关基因的表达和抑制乙烯的合成来促进植物的生长。鉴定了一个亚精胺合成的转录调控因子RBAM_RS17425。缺失转录因子RBAM_RS17245后，FZB42菌株的亚精胺产量显著提高，形成了结构更为致密的生物膜，该转录因子是亚精胺合成的负调控因子。研究还发现亚精胺除具有促生植物生长的作用，还能够促进生物膜形成和提高芽胞杆菌自身的耐盐性等生物学功能。为亚精胺的开发应用提供了理论基础。此外，我们还鉴定了芽胞杆菌另外一类具有促生抗菌作用的小分子挥发性有机化合物（VOCs）。通过气质联用对OKB105和D13产生的挥发性物质进行分析，鉴定出OKB105产生的7个挥发性物质和D13产生的12个挥发性物质。其中，癸醇和3,5,5-三甲基己醇对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌等多种植物病原细菌的生长具有广谱抑制作用，表明其在防治植物病害上具有很好的应用前景。