自噬激活在有机磷化合物中毒所致迟发性神经损伤中的作用及其转录调控机制的研究

Organophosphorus compounds can cause a type of toxic neuropathy known as organophosphate-induced delayed neuropathy (OPIDN) in human being. Although cases of OPIDN have been documented for over a century, the precise mechanism of OPIDN is still unknown. Our preliminary data indicated that tri-ortho-cresyl phosphate (TOCP), a potent OPIDN inducer, resulted in a significant increase in neuronal autophagy activity and up-regulating mRNA expression of autophagy-related-genes. However, the exact relationship between autophagy and the delayed neuropathy remains unclear. This project primarily aims to detect the time-course of neuronal injury and autophagy activation in in vivo and in vitro models following TOCP, observe whether the inhibition of neuronal autophagy by pharmacological and genetic methods can prevent or reduce the axonal degeneration and neuronal apoptosis, and determine the exact role of autophagy in the pathogenesis of TOCP-induced delayed neuropathy. To further investigate the molecular mechanisms for autophagy activation, we will determine whether transcription factor EB (TFEB) is associated with the activation of neuronal autophagy by TOCP, and study the possible implication of mTORC1 and calcineurin in TFEB-mediated transcriptional regulatory machinery. The project is expected to reveal critical insights into molecular mechanisms underlying the initiation and development of OPIDN. Uncovering these mechanisms will expand our understanding of the pathogenesis of OPIDN, and lead to the development of new therapeutic strategies for preventing or curing OPIDN.

有机磷化合物是一类用途广泛的化学品，在人类中能诱发迟发性神经病（OPIDN）。OPIDN的发生机制目前尚未阐明，缺乏有效防治措施。我们前期研究发现三邻甲苯磷酸酯(TOCP)诱导的OPIDN中神经元自噬活性升高，自噬相关基因mRNA表达上调，但自噬激活与神经损伤之间的确切关系仍不清楚。本项目拟以TOCP诱导的神经元自噬激活为切入点，利用电镜、激光共聚焦、Western blot等技术从整体动物和离体细胞两个水平上研究OPIDN发生过程中神经元损伤和自噬流的动态变化，以及药物干预和自噬基因敲除对TOCP诱导的轴突损伤和神经元存活的影响，以明确自噬在OPIDN中的具体作用。在此基础上，研究转录因子EB（TFEB）介导的自噬基因转录调控与自噬激活之间的内在联系，以及影响TFEB活性的关键信号通路，从转录激活角度探讨有机磷毒物干扰神经元自噬引起轴突病变的分子机制，以期揭示OPIDN的发病机制。

有机磷化合物广泛用作农药、增塑剂、阻燃剂、润滑剂以及战争毒剂。有机磷化合物不仅能够抑制胆碱酯酶引起急性中毒，部分有机磷化合物还能在人类中诱发一种迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy, OPIDN）。到目前为止，有机磷神经毒物引起迟发性神经损伤的机制并不清楚，临床上缺乏有效的防治措施。本项目利用整体动物模型和细胞模型研究有机磷神经毒物-三邻甲苯磷酸酯(TOCP)诱导的OPIDN中神经元自噬变化与神经损伤之间的内在联系，明确自噬在OPIDN发生进程中的作用。在此基础上，进一步研究TOCP诱导神经元自噬激活的相关信号途径和关键靶分子，探讨有机磷神经毒物干扰自噬引起轴突病变的主要分子机制。研究发现TOCP诱导的OPIDN过程中神经元自噬活性明显增加，特别是Pink1-parkin介导的线粒体自噬降解通路显著激活，而自噬基因ATG7敲除能够显著缓解TOCP诱导的神经细胞损伤，结果支持自噬激活是TOCP引起神经元损伤、诱导OPIDN发生过程中的一个关键事件。进一步的研究发现，TOCP处理激活了SARM1介导的轴突变性机制和RIPK1-RIPK3-MLKL介导的程序性坏死信号通路，而自噬能调节上述信号通路中关键分子的表达水平，进而参与了TOCP诱导的神经元损伤和OPIDN发生。在此基础上，本项目从自噬相关蛋白的磷酸化修饰和自噬相关基因的转录调控两个水平上进一步探讨了OPIDN中自噬激活的分子机制，发现TOCP染毒不仅能够激活与自噬启动相关的CAMKKβ-AMPK-mTOR-ULK1信号通路，而且激活了转录因子TFEB介导的自噬相关基因转录机制，显著上调了自噬相关基因的mRNA水平。在自噬激活过程中，TOCP染毒诱导的神经细胞内钙离子浓度升高是一个关键的上游事件，TRPA1钙通道阻断剂HC-030031和钙离子络合剂BAPTA-AM均能有效抑制TOCP诱导的自噬激活和神经细胞损伤。综上所述，本项目从细胞自噬角度比较深入地探讨了有机磷神经毒物诱导迟发性神经损伤的潜在机制，研究结果不仅进一步加深了对OPIDN发生机制的认识，而且能为制定科学的OPIDN干预防治措施提供有价值的实验依据。